淺析系列肝素藥物質(zhì)量分析及控制研究

田玉曄

摘?要：肝素是臨床醫(yī)學(xué)較為常用的一種抗凝劑，近年來(lái)，臨床醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)兩大學(xué)科的科研成果不斷顯現(xiàn)，使肝素的應(yīng)用范圍也隨之?dāng)U大，尤其在抗炎殺菌、調(diào)節(jié)免疫、抗動(dòng)脈硬化、抗腫瘤等藥理學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。但是，由于肝素提取自天然動(dòng)物組織，質(zhì)量屬性難于控制，無(wú)形當(dāng)中增加了患者的用藥風(fēng)險(xiǎn)。因此，本文將以提高肝素藥物質(zhì)量的安全可靠性為主要目的，圍繞系列肝素藥物的質(zhì)量分析與控制方法展開(kāi)論述。

關(guān)鍵詞：系列肝素藥物;質(zhì)量分析;控制方法

本文利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)肝素分子量進(jìn)行檢測(cè)，利用離子色譜法對(duì)肝素中氨基糖的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對(duì)肝素中的硫酸根進(jìn)行定量定性分析。通過(guò)采用現(xiàn)代儀器分析法，能夠深入探究肝素中各個(gè)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)肝素藥物的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，以降低患者的用藥風(fēng)險(xiǎn)，為肝素藥物在臨床醫(yī)學(xué)與藥理學(xué)的實(shí)際應(yīng)用提供確鑿的數(shù)據(jù)支持。

1 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析肝素分子量

1.1 質(zhì)量分析基本原理

聚丙烯酰膠凝膠電泳檢測(cè)法將聚丙烯酰胺凝膠作為中間介質(zhì)，該介質(zhì)主要由甲叉雙丙烯酰胺以及丙烯酰胺聚合而成，較為常見(jiàn)的兩種聚合方法為化學(xué)聚合與光聚合?；瘜W(xué)聚合的基本反應(yīng)原理是：S2O82-+e-→SO42-+SO4-，如果R·表示自由基，M表示丙烯酰胺單位，聚合過(guò)程反應(yīng)式可以表示為：R·+M→RM·，RM·+M→RMM·，RMM·+M→RMMM·?ect·當(dāng)CH2=CH-乙烯基依次聚合，就構(gòu)成了丙烯酰胺長(zhǎng)鏈，進(jìn)而為甲叉鍵交聯(lián)創(chuàng)造了有利條件，然后在甲叉鍵交聯(lián)作用下形成一個(gè)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而用于光聚合的催化劑是核黃素，該物質(zhì)在光合作用下，本身產(chǎn)生自由基，并在兩到三小時(shí)之內(nèi)就可以完成化學(xué)聚合反應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)階段

此次分析肝素分子量實(shí)驗(yàn)采用的標(biāo)準(zhǔn)樣品是檢定合格的肝素鈉，實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)自于國(guó)內(nèi)某制藥企業(yè)，而酶部分降解低分子量肝素與肝素8糖樣品均產(chǎn)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。實(shí)驗(yàn)采用的儀器是電泳儀裝置、脫色搖床，實(shí)驗(yàn)主要試劑是硼酸、甘氨酸、鹽酸等。

實(shí)驗(yàn)方法是：首先將6ml分離膠膠液與36μLAPS與2μLTEMED混合，當(dāng)膠液混合均勻后靜置30分鐘，然后將其倒出水封，再取2mL濃縮膠，加梳子，同樣靜置30分鐘，取出梳子后，加入緩沖液，接下來(lái)取一個(gè)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品與兩個(gè)樣品各5μL，與同樣容積的50%的蔗糖溶液混合在一起，靜置30分鐘，當(dāng)接通電源后，將電壓調(diào)整為200V。電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將凝膠片取出，并對(duì)其進(jìn)行染色處理，靜置30分鐘后，在經(jīng)過(guò)脫色搖床脫后，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察[1]。

1.3 結(jié)果分析

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品與樣品PAGE圖譜如下圖所示。其中數(shù)字1，2，3，4代表樣品，5，6代表肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，7代表酶部分降解低分子量肝素，8代表肝素8糖。

從實(shí)驗(yàn)圖譜中可以清晰直觀的發(fā)現(xiàn)，肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品與樣品并沒(méi)有顯著區(qū)別，分子量均達(dá)到20糖以上，這說(shuō)明肝素質(zhì)量較純，通過(guò)PAGE圖譜法，能夠快速的分析出肝素中的分子量分布情況，并且具有檢測(cè)靈敏度高、操作方便快捷、數(shù)據(jù)信息準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，是目前肝素分子量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中較為常用的一種方法。

2 利用離子色譜法分析肝素氨基糖結(jié)構(gòu)組成

2.1 分析檢測(cè)原理

離子色譜法是近年來(lái)出現(xiàn)的分析檢測(cè)糖類(lèi)物質(zhì)的一種新技術(shù)，檢測(cè)原理是：利用單糖與寡糖在PH值大于12的情況下，解離離子型物質(zhì)的陰離子，這種檢測(cè)方法能夠明顯區(qū)分開(kāi)氨基葡萄糖以及氨基半乳糖，因此，可以將其作為一種特異性的氨基糖純度分析檢測(cè)法[2]。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

該實(shí)驗(yàn)分兩次取測(cè)試樣品，以降低檢測(cè)結(jié)果的誤差值，檢測(cè)色譜條件是高壓梯度的離子色譜，安培脈沖檢測(cè)品流動(dòng)相以及15mMNaOH溶液。色譜柱溫度為25℃，流速是1mL/min，樣品進(jìn)入量為20μL，采集時(shí)間為20分鐘。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品與氨基半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品單獨(dú)進(jìn)樣檢測(cè)分析時(shí)，氨基葡萄糖的保留時(shí)間約為8.5min，而氨基半乳糖的保留時(shí)間為7.35min。在測(cè)試肝素鈉樣品時(shí)，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)中均不含有氨基半乳糖，這就可以證實(shí)，實(shí)際摻入的物質(zhì)是肝素類(lèi)似物。此外，在測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品與樣品時(shí)均出現(xiàn)了約9.98min的未知物，經(jīng)過(guò)分析可以得出結(jié)論，這種未知物極有可能是TFA降解時(shí)的產(chǎn)出物。可見(jiàn)，離子色譜法分析肝素氨基糖物質(zhì)時(shí)，重現(xiàn)性好、靈敏度高，該檢測(cè)法對(duì)Elson-Morgan法給予補(bǔ)充，使肝素藥物的服用安全性更高。

3 利用離子色譜法分析檢測(cè)肝素硫酸根

3.1 分析檢測(cè)原理

離子色譜法作為一種高效的液相色譜法，具有使用樣品少、檢測(cè)速度快、數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度高、操作便捷等優(yōu)勢(shì)，因此，可以用該方法定量定性分析肝素鈉中的陰離子硫酸根，比較常用的分析方法包括比色法以及滴定法。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論，離子色譜法具有較好的重現(xiàn)性，其中F-、Cl-、Br-、NO3-、SO4-、PO43-等負(fù)離子保留的時(shí)間分別為4.04min、5.83min、8.58min、9.73min、13.44min、15.42min。該實(shí)驗(yàn)的水解樣品與未水解的樣品均出現(xiàn)了彌5.82minCl-峰，由此可以判斷該物質(zhì)來(lái)自于NaCl，這就說(shuō)明在制備肝素鈉樣品時(shí)脫鹽不徹底，但是Cl-的含量并未超標(biāo)，滿(mǎn)足≤0.52%的標(biāo)準(zhǔn)范圍，此外，在水解樣品中存在約7.92min峰的三氟乙酸離子。利用離子色譜法對(duì)肝素鈉硫酸根進(jìn)行檢測(cè)分析，具有安全性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，而且具有較高的分辨率以及靈敏度，進(jìn)而能夠得到精準(zhǔn)的硫酸根含量數(shù)值。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)肝素藥物中分子量、氨基糖以及硫酸根的測(cè)定與分析，能夠準(zhǔn)確了解和掌握組成肝素藥物化學(xué)成分的含量以及結(jié)構(gòu)屬性，進(jìn)而對(duì)肝素藥物質(zhì)量進(jìn)行有效控制，讓更多的患者吃上放心藥，為患者的身體健康保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉利.系列肝素藥物質(zhì)量分析及控制研究[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2014.

[2]顏明明，劉利月，戴婷婷，等.低分子肝素類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2018，16（18）：39-40.