PM2.5對AngⅡ誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的研究

李崗 鄧宇亭 陳冬梅

【摘要】 目的：研究PM2.5和AngⅡ的共同干預下，人臍靜脈血管內皮細胞的凋亡率及可能的凋亡機制。方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞株，分別以不同濃度PM2.5、AngⅡ、PM2.5+AngⅡ處理24、48 h，CCK-8法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測凋亡相關蛋白p-AKT的表達變化。結果：48 h CCK-8結果顯示，PM2.5在100.00、200.00、800.00 μg/mL時、AngⅡ在20.00 μmol/L時與對應組別的PM2.5+AngⅡ組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。進一步的流式結果顯示，48 h時PM2.5+AngⅡ組凋亡率與單PM2.5或AngⅡ處理比較，差異均有統計學意義（P<0.01，P<0.001）。Western Blot結果顯示，PM2.5+AngⅡ處理比單PM2.5或單AngⅡ處理后P-AKT的表達量下調，差異均有統計學意義（P<0.005）。結論：本研究表明體外實驗中，PM2.5對AngⅡ誘導血管內皮細胞凋亡具有促進作用，并可能通過PI3K/Akt/eNOS信號通路來實現。

【關鍵詞】 細顆粒物 AngⅡ P-AKT 人臍靜脈內皮細胞 凋亡

Effect of PM2.5 on Apoptosis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by AngⅡ/LI Gang， DENG Yuting， CHEN Dongmei. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： 00-006

[Abstract] Objective： To study the apoptosis rate and possible apoptosis mechanism of Human Umbilical Vein Endothelial Cells （HUVEC） under the co-intervention of PM2.5 and AngⅡ. Method： HUVEC were treated with different concentrations of PM2.5， AngⅡand PM2.5 + AngⅡ for 24 and 48 h. The cell activity was detected by CCK-8 assay and the apoptosis rate was detected by flow cytometry （FCM）. The expression of apoptosis-related protein p-AKT was detected by Western blot. Result： The results of CCK-8 showed that there were significant differences between PM2.5 at 100.00， 200.00， 800.00 μg/mL and AngⅡ at 20.00 μmol/L and PM2.5 + AngⅡ （P<0.05）. The further results of FCM showed that there were differences significantly between PM2.5 with AngⅡ and single PM2.5 or single AngⅡ treatment group in the apoptosis rate （P<0.01， P<0.001）. The results of Western Blot showed that the expression of p-AKT in PM2.5 with AngⅡ treatment group was significantly lower than that in single PM2.5 or single AngⅡ treatment group （P<0.005）. Conclusion： This study shows that in vitro experiments， PM2.5 can promote the apoptosis effect of AngⅡ to HUVEC. It may be achieved through PI3K/Akt/eNOS signaling pathway.

[Key words] PM2.5 AngⅡ P-AKT Human umbilical vein endothelial cells Apoptosis

First-authors address： School of Basic Medicine， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.001

近些年，隨著我國城市化進程的加快，大氣污染備受關注。其中，顆粒物對人體健康有著嚴重的危害性[1]。根據粒徑大小，大氣顆粒物被分成總懸浮顆粒物（total suspended particles，TSP）、可吸入顆粒物（inhalable particles，PM10）、細顆粒物（fine partieles，PM2.5）和超細顆粒物（ultrafine particles，UFP）四類。其中PM 2.5粒直徑小、表面積大，吸附的重金屬和有毒物質較多，在大氣中停留時間長、輸送距離遠，且可直接到達終末肺泡，在呼吸系統中易于溶解吸收，對人體健康危害最為嚴重。大量流行病學研究表明PM2.5能增加人體呼吸和心血管系統疾病的發(fā)生率，有調查顯示霧霾天醫(yī)院住院人數明顯增加，其中主要是以呼吸和心血管系統疾病患者常見[2-3]。血管內皮細胞損傷可引起心血管疾病的發(fā)生，這是心血管疾病的一個重要病因[4-5]。而血管內皮細胞損傷的一個重要因素就是血管組織局部RAS系統激活，AngⅡ（血管緊張素Ⅱ）作為該系統的活性肽，當其與受體AT1R結合后對血管內皮細胞功能及結構發(fā)揮損害作用。文獻[6]表明AngⅡ可誘導血管內皮細胞凋亡，同時也有研究表明暴露于PM2.5中，內皮細胞的AngⅡ濃度能夠增加[7]。但并未見PM2.5對AngⅡ誘導血管內皮細胞凋亡作用的相關文獻報道，因此通過本實驗來探究大氣污染物PM2.5與AngⅡ及血管內皮細胞凋亡的相關性，為進一步探究大氣污染對心血管疾病的發(fā)生機制提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 低溫高速離心機（eppendorf，Centrifuge 5804 R），CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡（OLYMPUS，CKX310），酶標儀（TECAN，infinite M200 PRO）;流式細胞儀，蛋白電泳儀（BIO-RAD，Mini-PROTEAN Tetra System），電轉儀和曝光機。

1.2 主要試劑 DMEM完全高糖培養(yǎng)液（江蘇凱基生物技術股份有限公司），TBD胰蛋白酶（Solarbio），細胞活力檢測試劑盒（CCK-8）（Eno Gene Cell TM CountingKit-8），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（Solarbio），RIPA組織/細胞裂解液（Solarbio），BCA蛋白濃度試劑盒（Solarbio），彩虹180廣譜蛋白Marker（Solarbio），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solarbio），ECL Plus熒光檢測試劑（Solarbio），抗P-AKT抗體（EnoGene，E1A0016），HRP標記的羊抗兔IgG（EnoGene）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PM2.5的制備 在遼寧省沈陽市交通要道（周圍無明顯污染源）使用120F型大流量粉塵采樣器（采樣流量：1 000 L/min）進行大氣PM2.5采樣，采樣時間選擇冬季采暖季節(jié)，每天連續(xù)采集24 h，含塵濾膜于-20 ℃短期保存。采集所用濾膜為恒重的玻璃纖維濾紙，將采有PM2.5的濾膜裁剪成（2×2）cm2大小，于高壓蒸汽滅菌后的燒杯中使用三蒸水浸泡，超聲振蕩10 min后，用六層紗布過濾震蕩液，連續(xù)浸泡、震蕩、過濾3次，將濾液于低溫超速離心機中離心（1 000 r/min，4 ℃）棄去上清液，收集底層顆粒物，冷凍后真空干燥，稱重后計算粉塵量，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，使用時按照濃度進行制備。

1.3.2 細胞培養(yǎng) HUVEC用DMEM完全高糖培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)取對數生長期用于實驗。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞活性 將細胞制成懸液，以每孔8×103個接種96孔板。實驗分為對照組，PM2.5組（PM2.5終濃度分別為50、100、200、400、800 μg/mL），AngⅡ組（AngⅡ終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ組（終濃度為50.00 μg/mL+1.25μmol/L、100.00 μg/ml+2.50 μmol/L、200.00 μg/ml+5.00 μmol/L、400.00 μg/mL+10.00 μmol/L、800 μg/mL+20 μmol/L）。每組設3個復孔。分別于24、48 h后檢測結果按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在450 nm處檢測各孔吸光度（OD）值。細胞存活率（%）=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 以每孔30×104個接種到6孔板，實驗分為：對照組，PM2.5組

（400.00 μg/mL），AngⅡ組（20.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ組（400.00 μg/mL+20.00 μmol/L），培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶將細胞消化下來，制成懸液，用預冷PBS洗滌一次，用1 mL Binding Buffer重懸細胞，取100 μL懸液，先在室溫避光條件下用5 μL Annexin V-FITC染色10 min，再加入5 μL PI 孵育5 min，最后加入PBS至500 μL，1 h內流式細胞儀檢測。

1.3.5 Western Blot法檢測凋亡相關蛋白 以每孔30×104個接種到6孔板，分組同上。48 h后，用預冷PBS洗滌，在孔板中加入含PMSF的RIPA細胞裂解液在冰上裂解。4 ℃、11 000 g，離心4 min，取上清，用BCA法測蛋白濃度。后取5 μg蛋白，進行SDS-PAGE分離，分離后用PVDF膜進行轉膜，轉膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉，清洗后孵育一抗（抗P-AKT抗體），二抗（HRP標記的羊抗兔IgG），內參，最后用ECL法顯色，曝光拍照，用Image J 分析軟件分析條帶的灰度值，用目標蛋白與GAPDH灰度值的比值來表示蛋白的相對表達水平。

1.4 統計學處理 以GraphPad Prism 6統計軟件進行分析，計量資料采用（x±s）表示，多樣本組間比較采用多因素方差分析（Two-way ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 （1）24 h時對照組OD值為（2.620±0.019），PM2.5組（PM2.5終濃度分別為50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μg/mL）OD值分別為（2.384±0.295）（2.173±0.149）（1.992±0.066）（1.789±0.343）（1.656±0.269），AngⅡ組（AngⅡ終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L）OD值分別為（2.493±0.087）（2.298±0.088）（2.163±0.373）（2.063±0.204）（1.961±0.170），PM2.5+AngⅡ組（終濃度為50.00 μg/mL+1.25μmol/L、

100.00 μg/mL+2.50 μmol/L、200.00 μg/mL

+5.00 μmol/L、400.00 μg/mL+10.00 μmol/L、800.00 μg/mL+20.00 μmol/L）OD值分別為（2.299±0.077）（2.147±0.181）（1.806±0.094）（1.773±0.044）（1.812±0.509）。各處理組OD值與對照組相比，均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。（2）48 h各處理組OD值為（2.425±0.015），PM2.5組（PM2.5終濃度分別為50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μg/mL）

OD值分別為（1.971±0.074）（1.904±0.135）（1.893±0.059）（1.160±0.270）（1.599±0.489），AngⅡ組（AngⅡ終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L）OD值分別為（1.906±0.157）（1.677±0.137）（1.104±0.096）（1.086±0.163）

（1.671±0.201），PM2.5+AngⅡ組（終濃度為50.00 μg/mL+1.25μmol/L、100.00 μg/mL+

2.50 μmol/L、200.00 μg/mL+5.00 μmol/L、

400.00 μg/mL+10.00 μmol/L、800.00 μg/mL+

20.00 μmol/L）OD值分別為（1.691±0.104）（1.196±0.210）（0.942±0.412）（0.940±0.247）（0.443±0.104）。各處理組OD值均低于對照組比，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。PM2.5在100.00、200.00、800.00 μg/mL時，AngⅡ在20.00 μmol/L時，與對應組別的PM2.5+AngⅡ處理相比差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1、2。

PM2.5+AngⅡ（50.00 μg/mL+1.25 μmol/L）;2示PM2.5（100.00 μg/mL），AngⅡ（2.50 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（100.00 μg/mL+2.50 μmol/L）;3示PM2.5（200.00 μg/mL），

AngⅡ（5.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（200.00 μg/mL+5 μmol/L）;4示PM2.5（400.00 μg/mL），AngⅡ（10.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（400.00 μg/mL+10.00 μmol/L）;5示PM2.5（800.00 μg/mL），AngⅡ（20.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（800.00 μg/mL+20.00 μmol/L）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001，與對照組比較。

PM2.5+AngⅡ（50.00 μg/mL+1.25 μmol/L）;2示PM2.5（100.00 μg/mL），AngⅡ（2.50 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（100.00 μg/mL

+2.50 μmol/L）;3示PM2.5（200.00 μg/mL），AngⅡ（5.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（200.00 μg/mL+5.00 μmol/L）;4示PM2.5（400.00 μg/mL），AngⅡ（10.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（400.00 μg/mL

+10.00 μmol/L）;5示PM2.5（800.00 μg/mL），AngⅡ（20.00 μmol/L），PM2.5+AngⅡ（800.00 μg/mL+20.00 μmol/L）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001，與對照組比較;ΔΔP<0.01，ΔΔΔP<0.005，與PM2.5+AngⅡ組比較。

2.2 各組血管內皮細胞凋亡檢測 流式細胞術檢測結果顯示，處理48 h后對照組細胞凋亡率為（5.837±0.527）%，PM2.5（400.00 μg/mL）組、AngⅡ（20.00 μmol/L）組、PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）組細胞凋亡率分為（10.017±0.876）、（8.513±0.612）、（13.047±0.520）%。各組細胞凋亡率與對照組比較差異均有統計學意義（P<0.01，P<0.01，P<0.005），PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）處理組與單用PM2.5（400.00 μg/mL）比差異有統計學意義（P<0.01），PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）處理與AngⅡ（20.00 μmol/L）組相比差異有統計學意義（P<0.005）。見圖3。

2.3 凋亡相關蛋白P-AKT檢測 48 h后，各組蛋白相對表達量：對照組為（2.094±0.420），PM2.5（400.00 μg/mL）組為（1.566±0.196），AngⅡ（20.00 μmol/L）組為（1.372±0.139），PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）組為（0.604±0.093）。各組與對照組相比，P-AKT的表達量均下降，差異均有統計學意義（P<0.05）;PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）處理組與單用PM2.5（400.00 μg/mL）比較，差異有統計學意義（P<0.05）;PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）處理組與AngⅡ（20.00 μmol/L）組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4、5。

3 討論

隨著城市化進程的加快，大氣污染在我國愈加嚴重。大氣污染物的細顆粒物對心血管疾病的影響在近些年的研究中已逐漸被證實。在臨床觀察統計中顯示，大氣顆粒物中PM2.5的升高可使多種心血管疾?。ǜ哐獕?、動脈粥樣硬化，缺血性心臟病和心力衰竭等）的發(fā)病率明顯上升[1，8-10]。2010年5月，美國心臟協會（AHA）指出細顆粒物暴露與心血管疾病發(fā)病率和死亡率存在明確的因果關系，細顆粒物暴露可視為心血管疾病發(fā)病和死亡的可改變危險因素。

血管內皮細胞為單層、裱襯在整個心血管系統內表面的上皮樣細胞，是形成心血管封閉管道系統的形態(tài)基礎，也是血管內膜的保護屏障。內皮細胞能夠分泌多種活性物質，具有維持循環(huán)系統穩(wěn)態(tài)的功能，包括調控血液與周圍組織之間的物質交換、維持正常的血液流動、調控血流、調節(jié)炎癥反應等。因此，正常的血管內皮細胞功能是維持心血管系統正常運行所必需的。研究表明血管內皮細胞功能與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有著極為密切的關系，內皮細胞的凋亡則被認為是心血管疾病獨立的危險因子[10]。動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管疾病中最常見的疾病之一，血管內皮細胞凋亡參與了AS的發(fā)生、發(fā)展過程[11]，被認為是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)。有研究表明PM2.5可通過上皮細胞間隙或借助巨噬細胞直接進入血液循環(huán)系統，對心血管能夠產生直接毒性作用，PM2.5能直接接觸血管內皮細胞引起其功能改變或損傷，最終促進心血管系統疾病的發(fā)生發(fā)展[11-12]。PM2.5作用于血管內皮細胞，導致內皮功能障礙，從而加速AS進展。內皮細胞損傷的一個重要因素就是血管組織局部RAS激活，該系統的活性肽AngⅡ（血管緊張素Ⅱ）與其受體AT1R結合后對內皮細胞功能及結構發(fā)揮損害作用。研究表明，AngⅡ可促進活性氧（ROS）的產生，過量的ROS能夠損傷內皮細胞，促使細胞凋亡，導致血管內皮功能障礙[6，13]。

本實驗采用體外細胞實驗，將PM2.5與AngⅡ分成不同處理組，體外作用于HUVEC。CCK-8法檢測各組細胞活性狀況，結果顯示：24 h時，各處理組OD值均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;48 h時，各處理組OD值均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;48 h時，PM2.5在100.00、200.00、800.00 μg/mL，AngⅡ在20.00 μmol/L時，與對應組別的PM2.5+AngⅡ處理相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。說明在處理達到48 h時，PM2.5對AngⅡ誘導血管內皮細胞凋亡有明顯的促進作用。后續(xù)實驗中采用流式細胞術來檢測PM2.5對AngⅡ誘導細胞凋亡的情況，48 h結果顯示：各組細胞凋亡率與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）組與AngⅡ（20.00 μmol/L）組相比，差異有統計學意義（P<0.005），說明單獨AngⅡ處理細胞后，細胞凋亡數增多，PM2.5+AngⅡ混合處理后，細胞凋亡數進一步升高。PM2.5（400.00 μg/mL）+AngⅡ（20.00 μmol/L）處理組與單用PM2.5（400.00 μg/mL）比較，差異均有統計學意義（P<0.01），說明PM2.5+AngⅡ的混合處理比PM2.5的單獨處理，對細胞凋亡的影響更顯著，進一步證實PM2.5對AngⅡ誘導血管內皮細胞凋亡具有促進作用。

PTEN（phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten gene，PTEN）是一種抑癌基因，近些年來隨著研究深入，科研人員發(fā)現PTEN在心肌肥大、動脈粥樣硬化及支氣管哮喘等領域也發(fā)揮重要的作用[14-15]。PTEN發(fā)揮經典的抑制細胞生長作用主要是通過其在膜上的磷酸酶活性抑制PI3K/AKT信號通路來實現。PTEN基因蛋白通過抑制PI3K/Akt的活性而調節(jié)細胞的生長，促進細胞凋亡。PI3K/AKT/eNOS信號通路在參與血管再生、心肌細胞代謝等發(fā)揮著重要作用[16]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，與細胞的生長和生存有關。而且Akt是抑制各種應激反應的生存因子，它的作用底物與許多生存相關蛋白，PI3K/AKT信號通路通過激活其下游通路，使AKT被激活為P-AKT，P-AKT通過磷酸化作用參與調節(jié)血管內皮細胞的遷移、增殖，參與抑制凋亡等[17-18]。有研究證實PI3K/AKT/eNOS信號通路具有抗氧化、抗凋亡等心肌保護作用，AngⅡ可引起PI3K/AKT/eNOS信號通路的損傷，導致心肌肥厚[19-20]。因此，為進一步探究PM2.5是否通過PI3K/AKT/eNOS信號通路增強AngⅡ對HUVEC的誘導凋亡作用。本實驗是體外細胞實驗，采用Western Blot法檢測P-AKT的相對表達量。結果顯示，與對照組相比，經PM2.5、AngⅡ、PM2.5+AngⅡ分別處理后P-AKT的表達量均下降，且PM2.5+AngⅡ組P-AKT的表達量明顯低于單獨PM2.5組和單獨AngⅡ組，差異有顯著性統計學意義（P<0.005），與相應的流式結果相符。進一步說明PM2.5對AngⅡ誘導血管內皮細胞凋亡可能是通過PI3K/Akt/eNOS信號通路來實現，具體機制還需進一步探究。

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（收稿日期：2019-06-27） （本文編輯：周亞杰）