乳酸鏈球菌L16 對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

任大勇 宮圣潔 朱劍威 王 迪 高良鋒 曲天銘 劉宏妍 于寒松*

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春 130118 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 長(zhǎng)春 130118）

腸道菌群對(duì)人類(lèi)健康起到關(guān)鍵作用[1]，腸道還是最大的免疫器官[2]。據(jù)估計(jì)健康成人胃腸道大約有1013個(gè)微生物[3]，這些微生物在繁衍過(guò)程中達(dá)到種類(lèi)和數(shù)量的平衡[4]。然而，這種平衡可以通過(guò)干擾腸道而被破壞[5]。一旦腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，則會(huì)引起各種代謝類(lèi)疾病[4]。同時(shí)，腸道菌群還與免疫類(lèi)疾病、胃腸道類(lèi)疾病甚至精神類(lèi)疾病相關(guān)聯(lián)[6]。由于腸道微生物種群對(duì)外部和內(nèi)部環(huán)境變化高度敏感，所以導(dǎo)致腸道菌群組成迅速改變[7]，從而使病原菌過(guò)度生長(zhǎng)[8]。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧球菌[9]，在不同環(huán)境生存的條件下，能夠增殖和定植組織[10]，促發(fā)腸道感染[11-12]。前期實(shí)驗(yàn)中，小鼠感染金黃色葡萄球菌后體重降低，感染期間血清中細(xì)胞因子IFN-γ 顯著增加，細(xì)胞因子IL-4 顯著降低[13]，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。這說(shuō)明一旦被金黃色葡萄球菌感染，將嚴(yán)重影響機(jī)體健康。

益生菌是定植于人體腸道內(nèi)，能夠產(chǎn)生健康功效的活的有益微生物的總稱(chēng)[4]，主要包括乳酸菌、鏈球菌、芽孢桿菌等[14]，在腸道內(nèi)生殖繁衍，調(diào)節(jié)腸道紊亂的菌群結(jié)構(gòu)，提高機(jī)體免疫力[4]，幫助機(jī)體恢復(fù)健康?？诜嫔軌蛑斡蚓徑舛喾N胃、腸道或與胃、腸道相關(guān)的疾病[4]。有研究表明，發(fā)酵乳酸菌在環(huán)境和食物中有氧的情況下含量豐富，它們構(gòu)成了腸道共生菌群的主要部分，在正常情況下維持腸內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)條件[15]。乳酸鏈球菌是多肽物質(zhì)，不會(huì)造成腸道內(nèi)正常菌群失調(diào)，它能刺激免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[16]。前期研究結(jié)果顯示，用乳酸鏈球菌L16 對(duì)感染金黃色葡萄球菌的小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的肝脹指數(shù)接近正常組，在感染期和恢復(fù)期，血清中IFN-γ 和IL-4 的比值顯著降低，預(yù)防組和治療組小鼠腸內(nèi)容物中sIgA 的分泌較正常組和模型組高，且預(yù)防組腸內(nèi)容物中sIgA 的分泌高于治療組，與臨床癥狀一致[17-18]。本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠糞便中所有細(xì)菌的16sRNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行DNA測(cè)序，分析乳酸鏈球菌L16 對(duì)金黃色葡萄球菌感染的小鼠腸道菌群的改善作用，探究小鼠感染金黃色葡萄球菌后，病癥的改善與腸道菌群結(jié)構(gòu)是否有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡無(wú)菌雌性昆明小鼠，體重18～20 g，長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，scXK（吉）2011-0003。

1.2 菌株

乳酸鏈球菌L16，提取于農(nóng)家發(fā)酵食品，在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，7 500 r/min 離心2 min，用0.9%無(wú)菌鹽水稀釋成109CFU/mL。金黃色葡萄球菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院毒理學(xué)試驗(yàn)室分離并保存，將其在LB 培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)24 h，稀釋成106CFU/mL。4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。試?yàn)結(jié)束后，將細(xì)菌高溫殺菌。

1.3 儀器與設(shè)備

BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；H-2050R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QL-866旋渦混合器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ 無(wú)菌操作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；KYC-100B 空氣恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHP-781 電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠(chǎng)；FA1004B 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.4 動(dòng)物喂養(yǎng)

5 周齡無(wú)菌雌性昆明小鼠，提供充足的水和鼠糧，由小鼠自由攝食。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)，溫度（20±1）℃，濕度50%±10%，自然光源。小鼠經(jīng)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分配到各籠中。

1.5 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)分為預(yù)防組（Protection）、治療組（Treatment）和對(duì)照組（正常組；模型組），（n=6）。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，預(yù)防組先灌服乳酸鏈球菌1 周，再灌服金黃色葡萄球菌1 周。治療組用金黃色葡萄球菌感染小鼠1 周后，再用乳酸鏈球菌進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組分為陰性對(duì)照組（Control）：提供充足水和糧食，自由攝食，以0.9%的無(wú)菌鹽水代替菌液灌服小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組（Model）：小鼠感染金葡菌1周，無(wú)乳酸菌干預(yù)。每天2 次灌胃，根據(jù)小鼠體重灌服乳酸鏈球菌（109CFU/mL）和金黃色葡萄球菌（106CFU/mL）以（10 mL/kg）計(jì)。通過(guò)腹腔注射進(jìn)行麻醉（200 mg/kg·只），麻醉劑由20%的異戊巴比妥和無(wú)菌鹽水以1∶3（V/V）的比例配制而成。

1.6 病原菌感染小鼠

每天觀(guān)察小鼠，與前期試驗(yàn)中小鼠感染后癥狀一致。感染初期伴有精神不佳，食欲不振；被毛聳立，排泄物粘連。繼續(xù)給藥，小鼠皮下出現(xiàn)膿包，部分表皮脫落，尾部較涼，相互擁擠蜷縮在一角，肛周紅腫。解剖后，病變小鼠內(nèi)臟顏色偏黑，嚴(yán)重小鼠內(nèi)脹氣味惡臭[13]?？瞻捉M小鼠未表現(xiàn)任何異常癥狀。

1.7 小鼠排泄物中菌群結(jié)構(gòu)的分析方法

小鼠糞便中微生物DNA 通過(guò)Omega 試劑盒提?。◤V州飛揚(yáng)生物工程有限公司）。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠糞便總DNA，所提取DNA 模板置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina 測(cè)序平臺(tái)。以16s rRNA V3-V4 區(qū)域帶barcode 的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。上下游引物分別為338F（5’-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3’）與806R（5’-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3’）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用（vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺(tái)進(jìn)行OTU 聚類(lèi)分析，所有序列的OTU分配，通常在OTU 生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的97%的相似水平。使用mothur 進(jìn)行稀疏分析，使用R 語(yǔ)言工具制作圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群結(jié)構(gòu)和層次聚類(lèi)分析

如圖1 所示，在門(mén)水平上，對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。預(yù)防組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes，49.03%）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，43.15%）的相對(duì)豐度接近正常組（44.75%；42.08%）；模型組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes，82.33%）和脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres，12.67%）的相對(duì)豐度較正常組顯著升高，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，1.40%）較正常組顯著降低。通過(guò)圖2 進(jìn)一步分析，預(yù)防組與正常組群落組成相似性最高，其次為治療組，而模型組與正常組有顯著差異。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌感染的模型組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)異于正常組。

2.2 OTU 相對(duì)豐度和熱圖

等級(jí)豐度分布曲線(xiàn)用于分析物種分布，物種的豐度越高，曲線(xiàn)在橫軸上的范圍越大，曲線(xiàn)越平緩，物種分布越均勻[19]。如圖3 所示，根據(jù)各組曲線(xiàn)在橫軸范圍分布及曲線(xiàn)平緩程度可以看出，模型組小鼠腸道菌群物種豐度和均勻度較正常組低，預(yù)防組小鼠腸道菌群物種豐度較高，且分布均勻。如圖4 所示，熱圖根據(jù)顏色深淺反映物種豐度，通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映各組樣本在門(mén)水平上群落組成的相似性和差異性。預(yù)防組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的豐度較高且接近正常組，模型組中各菌門(mén)豐度與正常組相比差異顯著。

圖1 小鼠腸道菌群門(mén)水平豐度Fig.1 Abundance of mice intestinal flora at phylum level

圖2 各組菌群結(jié)構(gòu)的層次聚類(lèi)分析Fig.2 Hierarchical clustering analysis for bacterial communities from different groups

圖3 等級(jí)豐度分布曲線(xiàn)Fig.3 OTU rank abundance distribution curve

圖4 各組門(mén)水平的熱圖Fig.4 Heatmap of groups at the phylum taxonomic level

2.3 小鼠腸道豐富性和多樣性

Shannon-Wiener 反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，當(dāng)曲線(xiàn)趨向平坦時(shí)，可以反映出樣本中大量微生物信息。如圖5 所示，預(yù)防組中小鼠腸道微生物多樣性指數(shù)最高，模型組最低。各組曲線(xiàn)趨向平坦，說(shuō)明各組小鼠腸道菌群微生物信息量充足。通過(guò)稀釋性曲線(xiàn)分析樣本菌群物種的豐富度及其數(shù)據(jù)合理性，如圖6 所示，進(jìn)一步分析，各組曲線(xiàn)趨向平坦，則測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，模型組中小鼠腸道微生物群落多樣性和豐富度較低，預(yù)防組中小鼠腸道微生物群落多樣性和豐富度較高。相比于模型組，預(yù)防組的稀釋性曲線(xiàn)更接近正常組。

2.4 菌群結(jié)構(gòu)維恩圖和組合分析圖

維恩圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目，選用相似水平為97%的OTU 樣本進(jìn)行分析，如圖7 所示，預(yù)防組和模型組與正常組重疊部分共有OTU 數(shù)目分別為229，163。相比于模型組，預(yù)防組與正常組的OTU 數(shù)目組成具有更高的相似性。進(jìn)一步分析各組菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，如圖8 所示，預(yù)防組小鼠腸道菌群中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的菌群組成與正常組最為相似。模型組小鼠腸道菌群中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）的菌群組成與正常組有顯著差異。

圖5 Shannon-Wiener 曲線(xiàn)Fig.5 Shannon-Wiener curve

圖6 稀釋性曲線(xiàn)Fig.6 Rarefaction curve

圖7 維恩圖Fig.7 Venn diagram

圖8 樣本聚類(lèi)樹(shù)與柱狀圖組合分析圖Fig.8 Hclust-bar

3 討論

腸道菌群豐富多樣，參與多種生理活動(dòng)[20]，腸道微生物群與很多疾病相關(guān)[21]，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定對(duì)人類(lèi)健康有重要作用，一旦平衡被破壞，容易引發(fā)疾病[5，22]。有研究表明，在金黃色葡萄球菌感染的腸道中，觀(guān)察到內(nèi)部盲腸壁的標(biāo)記厚度，肌層水腫，以及嚴(yán)重的出血情況[23]。由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的腸炎，是嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥之一，因?yàn)檫@種感染通常伴隨著快速惡化，一旦在感染初期延遲治療，可能危及生命[23]。因此預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染，使腸道保持健康至關(guān)重要。

大多數(shù)腸細(xì)菌屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）或擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），其中少部分細(xì)菌存在于變形菌門(mén)（Proteobacteria）和脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）[24]。本實(shí)驗(yàn)中，感染金黃色葡萄球菌的小鼠腸道中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）較正常組顯著增多，菌群結(jié)構(gòu)異常，平衡被破壞，在前期實(shí)驗(yàn)中，感染金黃色葡萄球菌的小鼠出現(xiàn)明顯病癥[13]，體重下降，血清中炎癥因子增加，免疫力降低，說(shuō)明腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡能夠?qū)е孪鄳?yīng)疾病的發(fā)生。

益生菌能夠限制病原體的定植和增殖，在腸道中起到有益作用[24]，促進(jìn)腸道菌群平衡，可使紊亂的腸道菌群恢復(fù)到正常結(jié)構(gòu)[20]，是一種能夠平衡宿主腸道菌群，產(chǎn)生活性物質(zhì)，同時(shí)對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物，是人類(lèi)及動(dòng)物腸道內(nèi)尤為重要的生理菌[4，14]。有研究表明，血清生化指標(biāo)的變化與腸道菌群的變化有關(guān)[25]，健康人群和患者之間的菌群結(jié)構(gòu)的比例不同，慢性腎臟疾病患者的腸道微生物群落較少，乳酸菌通過(guò)改變菌群成分，影響肝臟和腎臟的功能[25]。本研究采用乳酸鏈球菌L16 對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)結(jié)果分析可知，相比于模型組，預(yù)防組和治療組腸道菌群豐富多樣，尤其是預(yù)防組中的優(yōu)勢(shì)菌群，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的含量更接近正常組。前期試驗(yàn)中，乳酸鏈球菌L16 對(duì)金黃色葡萄球菌感染的小鼠內(nèi)脹起到預(yù)防保護(hù)作用，同時(shí)能夠恢復(fù)被感染小鼠體重的正常增長(zhǎng)，增加腸道中sIgA 的分泌，使IFN-γ/IL-4 比值從感染期到恢復(fù)期顯著降低[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌L16 可以改善由金黃色葡萄球菌引起的腸道紊亂，使腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)平衡狀態(tài)，同時(shí)還可以預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染小鼠出現(xiàn)的病癥。說(shuō)明腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，能使疾病得到緩解。

4 結(jié)論

乳酸鏈球菌L16 調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌感染的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，能夠改善金黃色葡萄球菌感染小鼠出現(xiàn)的病癥，通過(guò)以上分析可以看出，腸道菌群結(jié)構(gòu)與癥狀的改善密切相關(guān)，腸道健康有助于病癥恢復(fù)。