基于網(wǎng)絡藥理學探討丹參飲治療糖尿病心肌病的分子機制

楊金偉　趙燦　吳勇軍　劉秀　喻嶸

摘要：目的??采用網(wǎng)絡藥理學方法探討丹參飲治療糖尿病心肌病的化學成分、作用靶點及可能作用機制。方法??應用TCM?database@Taiwan、Chemistry?Database、HIT及Batman-TCM數(shù)據(jù)庫獲取丹參飲的化學活性成分及相關(guān)靶點信息，通過對比CTD及Gencards數(shù)據(jù)庫，歸納丹參飲化學成分中明確對糖尿病心肌病具有治療作用的靶基因，構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡圖。綜合藥物-疾病靶基因，使用String10.5構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡，使用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進行拓撲分析，對丹參飲關(guān)鍵化學成分及靶基因進行評價。通過DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對靶點基因功能進行富集分析，通過KEGG通路分析獲得參與的相關(guān)作用通路。結(jié)果??篩選得到丹參飲中91種化學成分和924個靶點對糖尿病心肌病有明確治療作用，成分-靶點網(wǎng)絡圖顯示成分與疾病靶點可能通過ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A等關(guān)鍵基因，經(jīng)由神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等通路發(fā)揮治療作用。結(jié)論??丹參飲通過多種藥物化學成分及靶點效應有效干預糖尿病心肌病，分析成分、靶點及通路的相互關(guān)系可為進一步實驗及臨床研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡藥理學;丹參飲;糖尿病心肌病;潛在靶點

中圖分類號：R259.872;R285.5????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0078-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812376

Discussion?on?Molecular?Mechanism?of?Danshen?Decoction?on?Diabetic?Cardiomyopathy?Based?on?Network?Pharmacology

YANG?Jinwei，?ZHAO?Can，?WU?Yongjun，?LIU?Xiu，?YU?Rong

Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?chemical?components，?targets，?and?potential?mechanism?of?Danshen?Decoction?in?treating?of?diabetic?cardiomyopathy?based?on?network?pharmacology.?Methods?The?TCM?database@Taiwan，?Chemistry?Database，?HIT?and?Batman-TCM?database?were?used?to?obtain?information?about?chemical?active?components?and?targets?of?Danshen?Decoction.?By?comparing?the?CTD?and?Gencards?databases，?the?target?genes?that?had?a?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?the?chemical?components?of?Danshen?Decoction?were?concluded.?A?component-target?network?map?was?constructed，?and?the?core?target?interaction?network?was?screened.?The?drug-disease?target?genes?were?synthesized，?and?the?String10.5?was?used?to?construct?a?target?interaction?network.?Network?Analyzer?tool?of?Cytoscape3.6.1?software?was?used?for?topological?analysis?to?evaluate?the?key?chemical?components?and?target?genes?of?Danshen?Decoction.?The?gene?function?enrichment?was?analyzed?with?DAVID6.8?database，?and?the?relevant?metabolic?pathways?were?analyzed?through?the?KEGG?pathway?analysis.?Results?Totally?91?chemical?components?and?924?targets?with?confirmed?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?Danshen?Decoction?were?obtained?after?screening.?The?component-target?network?map?showed?that?components?and?disease?targets?may?pass?key?genes?such?as?ADH1C，?SCN10A，?RYR3，?MED1?and?SCN5A，?via?neuroactive?ligand-receptor?interactions，?calcium?signaling?pathways，?cAMP?signaling?pathways，?cholinergic?synapses?and?proteoglycans?in?cancer?to?play?an?intervention?in?the?treatment?of?diabetic?cardiomyopathy.?Conclusion?The?same?and?different?chemical?components?and?target?effects?exist?between?Danshen?Decoction?effectively?interfere?with?diabetic?cardiomyopathy，?and?analyzing?the?relationship?between?components，?targets?and?pathways?can?provide

a?basis?for?further?experiments?and?clinical?applications.

Keywords：?network?pharmacology;?Danshen?decoction;?diabetic?cardiomyopathy;?potential?targets

糖尿病心肌?。╠iabetic?cardiomyopathy，DCM）是糖尿病并發(fā)的特異性心肌病，表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化，進一步影響心肌收縮舒張功能，常并發(fā)心力衰竭及心律失常[1]。DCM發(fā)生發(fā)展過程中存在多因素共同介導，糖脂代謝失衡、氧化應激及炎癥反應、心肌細胞的凋亡、心肌纖維化等參與DCM的進程[2-3]。調(diào)節(jié)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、改善微循環(huán)及保護心肌細胞是治療關(guān)鍵[4]。中藥存在復雜化學架構(gòu)，多組分、多靶點協(xié)同作用，用于DCM辨證治療具有明顯優(yōu)勢?！稌r方歌括》有“丹參飲，治心痛、胃脘諸痛多效”。丹參飲由丹參、砂仁、檀香3味藥組成。大鼠體內(nèi)實驗顯示，丹參飲具有保護心肌、維持血管內(nèi)皮完整抑制血小板聚集、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等多種藥理作用[5]。臨床研究表明，丹參飲可緩解DCM患者臨床癥狀，改善心肌細胞功能，提高綜合治療的有效性[6]。通過研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)作用靶點，可進一步闡明其作用機制。網(wǎng)絡藥理學整合藥物、靶點與疾病間相互作用的關(guān)聯(lián)性，從整體視角解析中藥與機體之間的作用關(guān)系，通過構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖，可系統(tǒng)并可視化多成分與多靶點之間的相互作用[7]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法構(gòu)建丹參飲的主要化學成分-靶點網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)藥物與疾病對應的作用靶點，明確丹參飲治療DCM的潛在分子機制，為進一步實驗及臨床研究提供依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??化學成分收集

以丹參飲組成藥物丹參、砂仁、檀香作為關(guān)鍵詞，通過中藥化學數(shù)據(jù)庫TCM?database@Taiwan（http：//?tcm.cmu.edu.tw/）[8]、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫Chemistry?Database（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及中草藥活性成分數(shù)據(jù)庫HIT（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）[9]?收集丹參飲主要化學成分，建立數(shù)據(jù)集。

1.2??潛在靶點預測

應用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-?tcm/）分析平臺[10]，在線提交丹參飲各單味藥化學成分信息，獲得與丹參飲可能作用靶點，以高可信度的蛋白作為靶點提取標準（Prediction?Score?cutoff>20）。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，通過輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱（official?symbol），經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的靶點信息[11]。

1.3??疾病靶點篩選

CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）提供關(guān)于化學-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化學疾病和基因-疾病關(guān)系的信息[12]。Gencards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）是整合詳細的人類基因信息（包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學、遺傳、臨床和功能信息）[13]。以“diabetic?cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，通過對比CTD、Gencards數(shù)據(jù)庫，歸納對DCM具有治療作用的靶點。

1.4??成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

將上述化學成分和靶點數(shù)據(jù)信息，剔除無對應靶點的化學成分及重復靶點后，導入Cytoscape3.6.1（https：//cytoscape.org/），構(gòu)建丹參飲化學成分-靶點網(wǎng)絡，并使用String10.5（https：//string-db.org/）構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡，對靶點網(wǎng)絡進行拓撲分析，探究成分與潛在靶點在其系統(tǒng)層面的復雜關(guān)系[14]。

1.5??網(wǎng)絡拓撲分析

運用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進行拓撲分析。通過計算網(wǎng)絡中各節(jié)點和邊的拓撲特征值，包括節(jié)點連接度（betweenness?centrality）及介度（degree），對丹參飲關(guān)鍵化合物及靶點進行評價。

1.6??基因富集分析

DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息[15]。將篩選得到的干預DCM作用靶點導入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，對靶點進行基因富集分析，通過KEGG通路分析獲得參與的相關(guān)通路，從分子生物學角度闡釋丹參飲治療DCM的作用機制。

2??結(jié)果與分析

2.1??有效成分及靶點

共篩選得到丹參飲治療DCM的化學成分91個、靶點924個，其中丹參成分和靶點分別為37、646個，砂仁成分和靶點分別為37、446個，檀香成分和靶點分別為20、513個。

2.2??成分-靶點網(wǎng)絡

丹參飲成分-靶點網(wǎng)絡見圖1，包括2150個節(jié)點（94個化合物節(jié)點、2056個靶點節(jié)點）和5415條邊，每條邊表示化合物分子與靶點之間的相互作用關(guān)系。丹參飲治療DCM的靶點相互作用網(wǎng)絡見圖2，包括557?個節(jié)點和6488條邊，平均節(jié)點度為23.3。

注：紅色、紫色、黃色節(jié)點分別表示丹參飲中丹參、檀香、砂仁的化合物分子，藍色節(jié)點表示藥物靶點

圖1??丹參飲治療DCM化學成分-靶點網(wǎng)絡

圖2??丹參飲治療DCM靶點相互作用網(wǎng)絡

2.3??靶點網(wǎng)絡拓撲分析

節(jié)點連接度表示網(wǎng)絡中與該節(jié)點相連路線的條數(shù)，連線較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡中起樞紐作用，可能是關(guān)鍵的化合物或靶點。丹參飲治療DCM靶點相互作用網(wǎng)絡中前15位靶點拓撲屬性見表1。前5位靶點為ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A，分別與13、12、12、11、11個化合物發(fā)生相互作用。

表1??丹參飲治療DCM靶點拓撲屬性分析（前15位）

2.4??靶點基因富集分析

對丹參飲治療DCM的有效成分靶點進行基因富集分析，結(jié)果見表2、圖3。丹參飲治療DCM參與的通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，表明丹參飲有效成分可能通過作用這些靶點所在的信號通路發(fā)揮治療DCM作用。

表2??丹參飲治療DCM靶點參與的KEGG通路分析

圖3??丹參飲治療DCM相關(guān)靶點-通路

3??討論

DCM是一種獨立于糖尿病大血管并發(fā)癥的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的疾病，其早期癥狀隱匿，進展性心肌細胞損害持續(xù)存在，后期易致糖尿病患者致命性心力衰竭[16]。心肌細胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化是DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理改變[17]。DCM病理機制包括糖、血脂代謝異常對心肌細胞損害;細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失常影響心肌細胞舒張和收縮功能異常;心臟自主神經(jīng)病變引起心率以及血流動力學發(fā)生異常的病理改變;腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活觸發(fā)心肌肥厚，并導致心功能不全的發(fā)生;胰島素抵抗心肌細胞的糖代謝效率，導致心臟的功能障礙等[18-19]。目前臨床對DCM的藥物治療主要以延緩心肌損傷、改善心肌代謝為主，難以修復受損心肌。中藥對DCM的早期治療及患者癥狀改善有明顯優(yōu)勢。丹參飲具有活血祛瘀、理氣止痛功效，廣泛應用于心血管疾病的治療。研究表明，丹參飲可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝，下調(diào)心肌血小板反應蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達水平，減輕DCM大鼠心肌纖維化，顯著延緩高血糖大鼠DCM進程[20]。

本研究通過對丹參飲進行網(wǎng)絡藥理學分析，對復方中單味藥物進行化學成分和相應的靶點基因進行篩選，綜合DCM相關(guān)靶基因信息，構(gòu)建了成分-靶點網(wǎng)絡。其中丹參平均靶點數(shù)目為49個，每個靶點平均與3種化合物相互作用;檀香平均靶點數(shù)目為51個，每個靶點平均與3種化合物相互作用;砂仁平均靶點數(shù)目為69個，每個靶點平均與4種化合物相互作用。單個化學成分可有多個靶點作用效應，同時，不同化學成分在同一靶點上也有交集，體現(xiàn)了中藥作用靶點廣泛、途徑多樣、功能豐富的特點?；衔锇悬c網(wǎng)絡中的關(guān)鍵靶點包括ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A。ADH1C是成熟肝細胞所特有的基因表達，可氧化腸道微生物產(chǎn)生內(nèi)源性乙醇，氧化類固醇和膽汁酸[21]。MED1作為PPARs等核受體和轉(zhuǎn)錄因子的激活子，可調(diào)控細胞代謝、增殖及分化，在肝臟中亦有明顯表達[22]。調(diào)節(jié)ADH1C表達可促進肝臟糖異生和糖分解平衡，而MED1可提升胰島素敏感性，使葡萄糖耐受性增加。碳水化合物在體內(nèi)過程富余時，多余的能量則轉(zhuǎn)化為脂肪酸，以三酰甘油和膽固醇的形式儲存于脂肪組織。ADH1C將乳糜顆粒加工成游離的脂肪酸和三酰甘油，促進轉(zhuǎn)運，穩(wěn)定血脂狀態(tài)。MED1具有氧化脂肪酸的能力，減少極低密度脂蛋白含量。丹參飲通過調(diào)節(jié)二者在肝臟中特異性表達，調(diào)節(jié)糖脂代謝水平，截斷DCM進程。人基因組中存在11種編碼電壓門控鈉離子通道（voltage-gated?sodium?channel，VGSC）α亞單位的基因。SCN5A編碼的Nav1.5對心臟組織中的鈉離子通道有特異性作用，在心肌細胞及特化的心臟傳導系統(tǒng)中均大量表達。SCN10A同樣在心臟電生理中有重要作用，與心肌傳導系統(tǒng)功能和多種心律失常密切相關(guān)[23]。丹參飲可干預SCN5A及SCN10A調(diào)節(jié)心肌細胞功能狀態(tài)和電生理過程，達到治療DCM的效應。丹參飲靶向細胞內(nèi)鈣信號通道基因RyR3，可影響Ca2+信使作用，調(diào)節(jié)機體神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細胞增殖與凋亡，在小腸黏膜上皮細胞中的穩(wěn)態(tài)效應可以促進葡萄糖吸收，維持心肌細胞的正常收縮舒張功能[24]。KEGG通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，由此推測丹參飲的有效成分可能通過作用于上述信號通路達到治療DCM的目的。其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路是質(zhì)膜上所有與細胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體配體的集合，與神經(jīng)功能關(guān)系最為密切。電生理活動和機械運動是心臟的基本活動形式，心肌細胞代謝障礙、自主神經(jīng)功能紊亂、胰島素抵抗及細胞因子等都參與了DCM的發(fā)生發(fā)展。在DCM病理狀態(tài)下，心臟電生理活動出現(xiàn)障礙及紊亂，進而影響心臟的泵血功能，引起血流動力學異常[25]。而心肌細胞外葡萄糖水平升高直接引起鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，通過鈣信號通路影響胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運，降低肌膜上的Na+-K+-ATP酶及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，造成鈣離子超載，導致心肌細胞損傷，心肌舒張期延長。細胞胞膜受損，肌動蛋白對外周鈣離子濃度敏感性下降，引起心室收縮功能障礙[26]。cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使，經(jīng)由PKA磷酸化信號轉(zhuǎn)導途徑中靶點調(diào)控細胞代謝功能，與血壓、心率及心肌收縮等心血管功能密切相關(guān)[27]。抑制心肌細胞內(nèi)cAMP蓄積，可減少心肌耗氧量，緩解過度激素及神經(jīng)遞質(zhì)釋放造成的心肌組織損傷，維持心肌正常不應期狀態(tài)，防止心率失常的發(fā)生。上述研究均佐證了網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析藥物與疾病靶點的相互作用關(guān)系，明確了丹參飲有效成分及其治療DCM潛在作用靶點，并通過KEGG通路分析闡釋其信號通路及分子機制，可為丹參飲干預DCM的臨床應用提供依據(jù)，為后續(xù)機制研究提供思路和方法。

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（收稿日期：2018-12-29）

（修回日期：2019-01-30;編輯：陳靜）