人工感染維氏氣單胞菌對(duì)雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽含量的影響

張永芳， 張 飄， 蔣 嫻， 米文琴， 冉越宇， 楊 浪， 姜海波， 文 明，2*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

鱘魚源于白堊紀(jì)時(shí)期的古老軟骨鱗魚，為硬骨魚綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱 (Actinopterygii)軟骨硬鱗總目(Chondrostei)鱘形目(Acipenseriformes)的成員，其肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。近年來(lái)，貴州省冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)特別是雜交鱘養(yǎng)殖得到快速發(fā)展，但雜交鱘疾病特別是細(xì)菌性疾病的危害也愈來(lái)愈大，因此細(xì)菌性疾病的防治研究成為保障鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重點(diǎn)之一。

抗菌肽(AMPs)是1類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)，是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[2]。自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)第1個(gè)抗菌肽即天蠶素(cecropins)并證明其具有抑菌作用后，迄今已發(fā)現(xiàn)2 000多種天然抗菌肽[3，4]。由于抗菌肽具有廣譜的抗菌活性和較大的研發(fā)價(jià)值，有關(guān)抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究報(bào)道較多，如盲鰻(Myxineglutinosa)、虹鱒(Oncorhynchus)、大西洋鮭(Salmosalar)等的應(yīng)用研究[5～7]，而對(duì)鱘魚的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以維氏氣單胞菌人工感染雜交鱘，檢測(cè)分析抗菌肽在感染雜交鱘體內(nèi)組織的含量動(dòng)態(tài)規(guī)律，以期為抗菌肽在鱘魚養(yǎng)殖上的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌種及試劑(1)實(shí)驗(yàn)用雜交鱘：購(gòu)自貴州大學(xué)水產(chǎn)研究所，共20尾，體重0.7～0.8 kg，體長(zhǎng)(55±5)cm，于室內(nèi)水族箱中養(yǎng)殖， 養(yǎng)殖水使用循環(huán)泵和充氣泵。(2)實(shí)驗(yàn)用維氏氣單胞菌菌種：貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所惠贈(zèng)，-80 ℃超低溫冰箱15%甘油保存。(3)主要試劑：腦心浸液(BHI)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；抗菌肽ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于江蘇綠葉生物科技有限公司。

1.2 維氏氣單胞菌菌種復(fù)蘇取保存的維氏氣單胞菌菌種1 mL于滅菌BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3 雜交鱘人工感染與樣品采集取雜交鱘隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組、人工感染組。正常對(duì)照組5尾，腹腔注射滅菌BHI培養(yǎng)液0.2 mL/尾；人工感染組15尾，腹腔注射維氏氣單胞菌液0.2 mL/尾。人工感染組分別在感染后24、48、96 h采集脾臟、肝臟、心臟、肌肉、腸道、鰓組織樣品；正常對(duì)照組在96 h 采集。各組織樣本置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽含量測(cè)定首先按照抗菌肽ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，以抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，建立抗菌肽含量與D450 nm值線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。然后取保存的雜交鱘組織樣品，剪取各組織樣品10 g于研缽中，加入生理鹽水 1.0 mL，研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒檢測(cè)步驟測(cè)定組織樣品中的抗菌肽D450 nm值，分析抗菌肽含量變化動(dòng)態(tài)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析收集正常對(duì)照組和人工感染組雜交鱘各個(gè)組織抗菌肽含量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以p-Value為依據(jù)，判定其是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按照抗菌肽ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，取抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋為待測(cè)樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，計(jì)6個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度測(cè)3個(gè)重復(fù)，以抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(含量)為橫坐標(biāo)，每個(gè)稀釋度D450 nm值為縱坐標(biāo)，建立抗菌肽含量與D450 nm值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)。經(jīng)測(cè)算，抗菌肽含量與其D450 nm值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=288.18x-3.157(R2=0.992 4)。

2.2 人工感染雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽含量動(dòng)態(tài)分析由表1、圖2可見(jiàn)：(1)正常對(duì)照組6個(gè)組織均有抗菌肽表達(dá)，其中在鰓和腸道組織中含量最高，而在肝臟中含量最低。(2)與正常對(duì)照組比較，人工感染組雜交鱘6個(gè)組織抗菌肽含量在不同時(shí)間段上均呈明顯升高，差異顯著(P<0.05)。其中：在24 h和96 h鰓和腸道組織抗菌肽含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)；在48 h肝臟、肌肉、心臟、脾臟抗菌肽含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。

表1 各組雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽D450 nm值

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；肩標(biāo)相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相間字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雜交鱘在維氏氣單胞菌感染后其機(jī)體內(nèi)抗菌肽含量顯著升高，提示抗菌肽在雜交鱘抗細(xì)菌感染中可能發(fā)揮著重要作用，這為今后抗菌肽在雜交鱘產(chǎn)業(yè)疾病防控中的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

4 討論

4.1抗菌肽不僅具有抗菌功能，而且還對(duì)真菌、病毒和腫瘤具有一定的抑制作用，因此抗菌肽愈來(lái)愈受到養(yǎng)殖行業(yè)的重視。目前有關(guān)魚類抗菌肽研究資料較多，但大多是從mRNA水平上開展研究，較少?gòu)牡鞍姿竭M(jìn)行研究分析。在外界因素刺激下(包括病原微生物感染)，動(dòng)物機(jī)體(包括魚類)的抗菌肽基因mRNA水平可能得到明顯提升，但不一定有效地表達(dá)出抗菌肽[8]。因此，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行抗菌肽基因水平的檢測(cè)，并不能真實(shí)反映動(dòng)物機(jī)體抗菌肽含量變化。

4.2本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測(cè)人工感染維氏氣單胞菌后雜交鱘6個(gè)組織器官抗菌肽的含量發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組和人工感染組雜交鱘鰓和腸中抗菌肽含量較其他組織高，且人工感染組極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。這與李偉等[9]研究正常牙鲆的結(jié)果“肝、鰓和脾等抗菌肽含量較高，而心和腸抗菌肽含量較低”不盡一致，可能是由于雜交鱘的鰓和腸與外界病原微生物接觸機(jī)會(huì)較多，受到刺激后產(chǎn)生的抗菌肽含量就會(huì)相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是正常對(duì)照組還是人工感染組，雜交鱘肌肉組織的抗菌肽含量較心臟、脾臟、肝臟組織的含量高。這可能是本實(shí)驗(yàn)在采集肌肉組織時(shí)未能完全剝離皮膚組織，而魚類皮膚組織表面黏液抗菌肽含量相對(duì)較高，從而導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的肌肉組織抗菌肽含量相對(duì)較高。有研究資料表明，某些魚類體內(nèi)抗菌肽還具有針對(duì)性，如石斑魚抗菌肽主要針對(duì)氣單胞菌[10]。本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了單一維氏氣單胞菌感染雜交鱘的抗菌肽含量變化分析，要明確雜交鱘抗菌肽是否具有針對(duì)性，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。