Ca2+、Mg2+對苦丁茶總黃酮提取及其抑菌活性的影響

張亦琳，延永，賀燕玲

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

苦丁茶（Ilex kudingcha），屬冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬常綠喬木，山坡、竹林、灌木叢中常見，在我國西南地區(qū)及華南地區(qū)廣泛分布[1]。據(jù)記載，這種植物已經(jīng)作為藥草使用了2000 多年，因其獨特作用而受到科學家的廣泛關(guān)注。豐富的黃酮類物質(zhì)[2]、氨基酸[3]、苦味苷[4]等物質(zhì)是苦丁茶獨具特色之處，而黃酮類物質(zhì)具有抑菌[5]、抗皮膚衰老[6-7]和消除自由基[8]的作用，一直以來是研究的熱點。隨著國際社會對化學藥品給人類社會造成潛在危害的反思和回歸自然的呼聲不斷提高，許多國家日益重視天然藥物的研究和開發(fā)，這是我國的中藥發(fā)展非常難得的機遇。據(jù)《本草綱目》記載，雨水、井水、露水對中草藥進行煎煮后，其藥效各有所不同[9]，其本質(zhì)原因是雨水、井水、露水的硬度不同，而硬水中離子含量最大的是Ca2+、Mg2+，研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子對藥物的療效有重要影響，藥物與金屬離子結(jié)合，形成配合體或鰲合物，促使體內(nèi)某一離子濃度受藥物的影響增加或減少，提高藥物療效或者增加其毒性，使藥物的臨床療效發(fā)生改變[10]。其可能的原因是離子與藥物形成配合體后，藥物的脂溶性增加，更易于透過細胞膜，有些藥物進入人體內(nèi)之后，必須與金屬離子配位，改變與其結(jié)合的原生物配體的生物功能，才能更好地發(fā)揮藥效。但在植物有效成分的提取研究中，尚未見關(guān)于重金屬離子對植物提取物及其生物活性影響的報道。本研究考察了自然界水中含量最多的Ca2+、Mg2+對苦丁茶總黃酮提取和抑菌活性的影響。通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化出引入Ca2+、Mg2+的最佳苦丁茶總黃酮提取工藝，得到引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物，通過抑菌試驗，得出Ca2+、Mg2+對苦丁茶總黃酮提取物抑菌活性的影響，為研究硬水中常見Ca2+、Mg2+對植物資源開發(fā)利用的影響提供新的思路和建立理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

苦丁茶購自四川峨眉山，經(jīng)鑒定品種為冬青科冬青屬苦丁茶干葉。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇（AR，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司），NaNO3、Al(NO3)3、MgCl2、NaOH、CaCl2（AR，天津科密歐化學試劑有限公司），蘆丁標準品（純度95%，中國藥品生物制品研究所），MH 培養(yǎng)基（BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司），紅四氮唑（AR，天津志遠科技有限公司），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（受贈于西北大學化學與材料科學學院）。

UV-225 紫外分光光度計（大連市儀器制造公司）、MLS-3780 高壓蒸汽滅菌鍋（上海鼎謙生物科技有限公司）、ZD-85 恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品中總黃酮提取率的測定

蘆丁標準曲線的繪制方法見文獻[10]，0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0161、0.0200、0.0241 mg·mL-1的蘆丁標準品稀釋液，放置15 min 后，在510 nm波長處分別測定吸光度（A）。以橫坐標X 為不同質(zhì)量濃度的蘆丁標品溶液，縱坐標Y 為溶液對應的吸光度值，繪制標準曲線。

取1 mL 提取液加入到25 mL 容量瓶，后續(xù)同文獻[10]，測定藥液的吸光度值，計算苦丁茶總黃酮提取率：

式中，Y 為苦丁茶總黃酮的提取率（%），C 為苦丁茶提取液質(zhì)量濃度（mg·mL-1），N 為提取稀釋倍數(shù)，V 為提取液體積（mL），W 為提取藥材的質(zhì)量（mg）。

1.3.2 單因素試驗

將苦丁茶粉末1.00 g 加入100 mL 單口圓底燒瓶，提取溶劑30 mL，提取溫度60 ℃，料液比1:30，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間2 h，Mg2+濃度200 mg·L-1，Ca2+濃度為 200 mg·L-1為基礎(chǔ)提取條件。將 Ca2+濃度分別調(diào)整為 125、150、175、200、225 mg·L-1，測試 Ca2+濃度對苦丁茶總黃酮提取率的影響； 將 Mg2+濃度分別調(diào)整為 125、150、175、200、225 mg·L-1，測試 Mg2+濃度對苦丁茶總黃酮提取率的影響；將乙醇體積分數(shù)分別調(diào)整為40%、50%、60%、70%、80%，測試乙醇體積分數(shù)對苦丁茶總黃酮提取率的影響；將提取時間分別調(diào)整為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，測試提取時間對苦丁茶總黃酮提取率的影響；將料液比分別調(diào)整為 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，考察料液比對苦丁茶總黃酮提取率的影響。

1.3.3 苦丁茶總黃酮的抑菌活性

MH 培養(yǎng)基的制備[11]，菌種活化[12]、菌懸液的配制參考文獻[13]。采用微量二倍稀釋法[14]，得到提取過程中引入Ca2+、Mg2+的提取物溶液的稀釋液，各孔總黃酮濃度分別為 97.44、48.72、24.36、12.18、6.09、3.05、1.52、0.76、0.38、0.19、0.10 mg·mL-1，對照品1 為不引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物稀釋液，各孔總黃酮濃度分別為114.08、57.04、28.52、14.26、7.13、3.57、1.78、0.89、0.45、0.22、0.11 mg·mL-1。對照品 2 為傳統(tǒng)苦丁茶總黃酮提取物溶液中加入Ca2+、Mg2+后的稀釋液，對應孔中總黃酮濃度與對照品1 各濃度相同。提取液、對照品 2、對照品 3 中 Ca2+、Mg2+濃度一致，第一孔濃度中分別為 181、180 mg·L-1。對照品 3 為 Ca2+溶液（第一孔中濃度 181 mg·L-1），對照品 4 為 Mg2+溶液（第一孔中濃度 180 mg·L-1），對照品 5 為 Ca2+、Mg2+溶液（濃度分別為 181、180 mg·L-1）。在上述各濃度藥液和對照品中依次加入100 μL 的三種菌液，無菌、恒溫37 ℃條件下放置24 h，觀察96孔板顏色，得到最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

通過Origin 模擬出總黃酮的線性回歸方程為 Y=9.9418X+0.0026（R2=0.9964）。分別將各因素水平提取液的吸光度值帶入式(1)，即可得與之對應總黃酮提取率。如圖1 所示，隨著Ca2+濃度增大，苦丁茶總黃酮的提取率不斷增大，當Ca2+濃度升高到175 mg·L-1時，黃酮提取率達到最大值9.74%，隨后出現(xiàn)下降趨勢，根據(jù)提取率高低，取Ca2+濃度為 150、175、200 mg·L-1三個水平進行響應面優(yōu)化；Mg2+濃度對提取的影響與Ca2+濃度相似，當 Mg2+濃度升高到 175 mg·L-1時，黃酮提取率達到最大值9.97%，根據(jù)提取率高低，選取Mg2+濃度為150、175、200mg·L-1的三個水平進行響應面優(yōu)化；乙醇體積分數(shù)在40%～60%時，與苦丁茶總黃酮的提取率成正相關(guān)，當乙醇體積分數(shù)增大到60%時，黃酮提取率達到最大值9.70%，根據(jù)提取率的高低，選擇50%、60%、70%的乙醇體積分數(shù)三個水平進行響應面分析； 提取時間在1 h 時，提取率達到最大值9.80%，隨后小幅下降，但其總體趨勢平穩(wěn)，故不做響應面分析，選用1 h 作為提取時間；在測試范圍內(nèi)，料液比與提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，料液比是1:30 時提取率達到最大值9.69%，根據(jù)總黃酮提取率的高低，選取料液比為1:20、1:30、1:40 三個水平進行響應面分析。

圖1 單因素對苦丁茶總黃酮的提取的影響

2.2 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設(shè)計

單因素試驗確定苦丁茶總黃酮提取工藝影響最大的因素水平，如表1 所示。利用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件中Box-Benhnken 方法設(shè)計響應面試驗。得出引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物的最佳提取工藝。

表1 苦丁茶總黃酮提取的響應面因素與水平表

利用Box-Benhnken 實驗設(shè)計，以苦丁茶總黃酮提取率（Y）為響應值，結(jié)果見表2。

經(jīng)軟件模擬得到回歸方程為：Y=10.02+0.109A＋0.024B－0.033C＋0.032D＋0.0580AB－0.07AC－0.015AD－0.098BC－0.22BD＋0.188CD－0.319A2－0.226B2－ 0.13C2－0.491D2

方差分析見表3，P<0.05 表示所建立模型具有高度的顯著性。模型的決定系數(shù)R2=0.94，說明因變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，回歸方程很好地模擬真實曲面，實驗可靠；R2Adj=0.88，說明該模型能解釋88%實驗數(shù)據(jù)的變異性，擬合程度高，誤差小。失擬項P=0.0501，不顯著，說明該模型與實際實驗擬合度良好，可用于苦丁黃酮提取的分析和預測。各因素標準回歸系數(shù)大小順序為A>C>D>B，對苦丁茶中黃酮提取率的影響大小順序為Ca2+濃度>乙醇體積分數(shù)>料液比>Mg2+濃度。

2.2.2 苦丁茶總黃酮提取的響應面交互作用分析

如圖2 所示，各因素交互作用下苦丁茶總黃酮得率的響應曲面可以很直觀地反映出各因素對苦丁茶總黃酮提取率的影響。乙醇濃度、料液比、Ca2+濃度、Mg2+濃度在測試范圍內(nèi)具有相互影響和作用。響應面曲面斜率越大說明對應的因素對提取影響顯著，綜合觀察，Ca2+離子對苦丁茶總黃酮提取影響最大，與回歸方程中的系數(shù)所表示的結(jié)果一致。

表2 苦丁茶總黃酮提取響應面試驗方案及結(jié)果

模型模擬得出苦丁茶總黃酮提取的最佳提取工藝條件為 Ca2+濃度為 180.58 mg·L-1、Mg2+濃度為179.56 mg·L-1、乙醇體積分數(shù)為56.94%、料液比（g：mL）為 1:29.30、提取 1 h，預測苦丁茶總黃酮提取率為10.04%。

2.3 驗證性試驗

為了便利操作將模擬工藝調(diào)整為Ca2+濃度為181 mg·L-1、Mg2+濃度為 180 mg·L-1、 乙醇體積分數(shù)為57%、料液比（g：mL）為1:29、提取為1 h，重復測試三次，苦丁茶總黃酮提取率分別為10.16%、10.12%、10.13%，平均值為10.14%，RSD=0.2054，表明提取工藝穩(wěn)定可靠，試驗結(jié)果與模型模擬值相近，傳統(tǒng)苦丁茶中總黃酮的得率為9.25%，可見，在提取中引入Ca2+與Mg2+能有效提高苦丁茶總黃酮的提取率。

表3 苦丁茶總黃酮提取的方差分析

2.4 苦丁茶中總黃酮的抑菌活性

由表4 所示，提取液對三種菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）最小抑菌濃度分別為 12.18、6.09、12.18 mg·mL-1，未引入 Ca2+、Mg2+提取液的最小抑菌濃度分別為14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，單獨的 Ca2+溶液、Mg2+溶液或 Ca2+與Mg2+溶液混合液對三種菌均沒有抑菌作用?？梢娨隒a2+、Mg2+后能顯著提升苦丁茶總黃酮抑菌活性，而傳統(tǒng)苦丁茶總黃酮提取物溶液中后補加入Ca2+、Mg2+則對抑菌活性影響不大，Ca2+溶液、Mg2+溶液或者Ca2+和Mg2+溶液無抑菌活性。可推測，提取過程引入Ca2+和Mg2+與苦丁茶總黃酮化合物可能生成某種具有較強抑菌活性的配合物，且反應條件與苦丁茶總黃酮的提取過程相似，而補加Ca2+、Mg2+由于沒有參與提取過程，缺少相應反應的條件，未形成較強抑菌活性的配合物。因此，提取過程中引入Ca2+和Mg2+有助于提升苦丁茶總黃酮的抑菌活性。

3 討論與結(jié)論

本文考察了Ca2+和Mg2+對苦丁茶的提取和抑菌生物活性的影響。通過單因素試驗，篩選出對苦丁茶總黃酮影響最顯著的因素水平，采用響應面分析中Box-Behnken 試驗設(shè)計優(yōu)化出苦丁茶總黃酮提取最優(yōu)工藝，即Ca2+濃度181mg·L-1、Mg2+濃度 180 mg·L-1、 乙醇濃度 57%、 料液比（g:mL）為 1:29，提取時間為 1 h。經(jīng)驗證，該工藝的提取率平均值為10.14%，與傳統(tǒng)的提取工藝比較提取率有小幅度的提升。測試了在提取過程中引入Ca2+、Mg2+提取液的抑菌效果，結(jié)果表明： 在苦丁茶總黃酮的提取過程中引入Ca2+、Mg2+后能顯著提升其抑菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC值為 14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，明顯低于對照組。

該工藝為苦丁茶的提取提供了更多的選擇，使得苦丁茶總黃酮的提取成本得到降低，提取溶劑由“蒸餾水+乙醇”延伸為“自來水+乙醇”。同時，提取物對本研究中三種測試菌的最小抑菌濃度有較為明顯的降低，可推測在提取過程中溶液中的Ca2+和Mg2+能與苦丁茶總黃酮化合物形成某種具有較強抑菌活性的配合物，因此，在苦丁茶總黃酮開發(fā)和利用過程中應該充分考慮并利用金屬離子對其活性的影響。本研究為中藥發(fā)展提供了新的思路，為研究離子對中藥藥效重要作用開辟了理論基礎(chǔ)。

圖2 各因素對苦丁茶總黃酮提取率影響的響應面圖

表4 苦丁茶中總黃酮的最小抑菌濃度（MIC）