傾向性評分匹配分析口咽癌PD-L1的表達與HPV感染及預(yù)后的相關(guān)性研究

高立明，朱瑩瑩，師曉華，陳興明*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.耳鼻咽喉科;2.病理科,北京100730)

口咽癌為頭頸部常見惡性腫瘤之一，90%以上為鱗狀細胞癌[1]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染已成為除吸煙和飲酒外口咽癌的又一重要致病因素[2]。全球每年約有32%的口咽癌(主要包括扁桃體癌及舌根癌)由HPV感染導(dǎo)致[3]。歐美國家相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)HPV陽性的口咽癌患者其臨床預(yù)后較HPV陰性者更好[2,4]。同時，最新的臨床試驗表明，HPV陽性和HPV陰性頭頸部鱗癌患者對免疫治療的反應(yīng)存在差異[5,6]，提示HPV陽性及HPV陰性頭頸腫瘤的免疫逃避機制可能不同。然而，程序性細胞死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)在口咽癌中的臨床意義尚不明確。本研究旨在探討PD-L1在口咽癌中的表達情況，分析其與HPV感染狀態(tài)及臨床預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008-2014年我院收治的確診為口咽鱗癌(原發(fā)灶為扁桃體或舌根)患者的臨床資料，納入50例HPV陽性的口咽癌患者，使用傾向性評分匹配(Propensity score matching，PSM)方法1∶1匹配納入50例HPV陰性口咽癌患者，所有患者按照2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)指定的TNM分級標準確定TNM分期。所有患者進行超過5年的長期隨訪或直至出現(xiàn)死亡。

1.2 PD-L1免疫熒光染色

采用常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，進行免疫熒光染色，EDTA緩沖液中進行微波抗原修復(fù)，PD-L1一抗4℃過夜孵化，洗滌后孵育熒光標記二抗，DAPI復(fù)染，熒光防淬滅劑封片后熒光顯微鏡觀察染色并照相記錄。膜性表達PD-L1的腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的比例≥ 5%定義為PD-L1陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用1∶1的比例運用PSM方法對50例HPV陽性口咽癌患者進行匹配，匹配因素包括年齡、性別、吸煙、腫瘤、原發(fā)灶、治療方式及分期。所有二分類變量用χ2檢驗(或Fisher精確檢驗)分析；有序分類變量用 Mann-Whitney 秩和檢驗分析。運用 Kaplan-Meier 法進行總生存率(overall survival，OS) 及疾病特異性生存率 (disease-specific survival，DSS)單因素分析，采用Cox比例風險模型進行多因素分析。以上所有分析均使用SPSS 22.0進行，均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

100例口咽癌患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、合并癥、分化程度、分期及治療方法等臨床資料見表1，兩組各匹配因素無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

隨訪時間為13-113個月，中位隨訪時間在HPV陽性組和HPV陰性組分別為67個月和47.5個月。隨訪期間共有53例患者死亡，45例患者死于口咽癌。HPV陽性組及HPV陰性組5年總生存率分別為66%和40%(P=0.003)，5年疾病特異生存率分別為73% 和44%(P=0.001)，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用COX多因素回歸分析，結(jié)果顯示，HPV陽性(HR=0.32，95% CI 0.18-0.58，P<0.001)、吸煙(HR=2.50，95% CI 1.27-4.91，P=0.008)、存在合并癥(HR=2.08，95% CI 1.07-4.01，P=0.032)及分化程度高(HR=0.26，95% CI 0.13-0.55，P<0.001)為口咽癌總生存率獨立預(yù)后因素，疾病特異生存率結(jié)果類似，但存在合并癥不再具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表1 100例口咽癌患者的臨床資料

縮寫：HPV，人乳頭狀瘤病毒a手術(shù)治療，包括手術(shù)，手術(shù)+放療，手術(shù)+放化療；b非手術(shù)治療，包括放療和化療

表2 口咽癌相關(guān)預(yù)后因素單因素與多因素分析

縮寫： HPV,人乳頭狀瘤病毒;CI,可信區(qū)間;HR,風險比;OS,總生存率;DSS,疾病特異性生存率

HPV陽性口咽癌組織中PD-L1陽性率為70%(35/50)，顯著高于HPV陰性口咽癌患者的42%(21/50)(P=0.005)。PD-L1陽性表達者多見于年輕患者(P=0.020)，而與其他臨床病理特征包括性別、吸煙、飲酒、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤分期及分化程度無明顯相關(guān)性。PD-L1陽性為改善口咽癌患者總生存率和疾病特異性生存率的獨立預(yù)后因素(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)(見圖1A)。

為進一步分析HPV陽性口咽癌患者與HPV陰性患者中PD-L1表達的相關(guān)預(yù)后差異，我們將其進行分組。結(jié)果提示，HPV+/PD-L1+患者較 HPV+/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P=0.004)，HPV-/PD-L1+者(DSS,P=0.010;OS,P=0.047) 以及HPV-/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)具有顯著的預(yù)后優(yōu)勢(見圖1B)。

圖1 口咽癌患者A) PD-L1；B) HPV/PD-L1 總生存率的Kaplan-Meier曲線

3 討論

HPV感染為口咽癌的重要致病因素之一，全球約31%的口咽癌由HPV感染導(dǎo)致[7]。HPV陽性口咽癌較HPV陰性口咽癌通常分期較晚，分化較差[8,9]。2010年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上報道了RTOG0129臨床試驗的部分研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HPV陽性口咽癌患者預(yù)后明顯較HPV陰性口咽癌患者預(yù)后要好，3年生存率分別為62.4%(95% CI,77.2-87.6)和57.1% (95% CI,48.1-66.1)[4]。此后，越來越多的研究提示HPV陽性口咽癌患者預(yù)后明顯改善。本研究通過傾向性評分匹配，納入50對HPV陽性及HPV陰性口咽癌患者，進一步證實了在中國人群中，HPV陽性為口咽癌良好預(yù)后的獨立因素(HR=0.32，95% CI 0.18-0.58，P<0.001)。

然而，HPV陽性口咽癌預(yù)后較好的機制尚不明確。部分學(xué)者將 HPV 陽性腫瘤預(yù)后較好歸因于對放化療的敏感性增強[10,11]。然而，單純手術(shù)的 HPV陽性腫瘤患者較分期相當?shù)腍PV陰性患者的預(yù)后仍有所改善[12]。Williams等發(fā)現(xiàn)表達E6/E7蛋白的HPV陽性腫瘤細胞在免疫活性小鼠中的增殖速度顯著落后于 HPV 陰性腫瘤，但同樣的實驗結(jié)果在免疫缺失的裸鼠體內(nèi)卻未被發(fā)現(xiàn)，據(jù)此推測 HPV 陽性腫瘤較好的臨床預(yù)后可能與機體的適應(yīng)性免疫相關(guān)[13]。免疫治療，尤其是針對PD-1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑在多種腫瘤(例如肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌等)治療中展現(xiàn)出良好前景，在頭頸部鱗癌中亦取得了不錯的療效。需要注意的是，僅小部分患者表現(xiàn)出持久療效。Checkmate 141[14]等臨床研究發(fā)現(xiàn)頭頸癌PD-L1陽性者接受PD-1抑制劑nivolumab治療后療效更好。因此有必要進行針對我國人群口咽癌患者進行PD-L1表達水平的檢測，以為HPV陽性患者更好的臨床預(yù)后提供理論基礎(chǔ)，同時為PD-1/PD-L1應(yīng)用于頭頸腫瘤提供基線數(shù)據(jù)。

口咽癌PD-L1的表達與HPV感染的相關(guān)性尚不明確。部分研究報道PD-L1的表達與HPV感染無明顯相關(guān)性[15,16]，而另外一些研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在HPV陽性頭頸腫瘤中表達率更高[17]。本研究發(fā)現(xiàn)口咽癌PD-L1的表達與HPV感染狀態(tài)存在顯著性相關(guān)。HPV陽性口咽癌組織中PD-L1陽性率(70%)顯著高于HPV陰性口咽癌患者的42%(P=0.005)。這些矛盾結(jié)果可能部分歸因于分析方法缺乏統(tǒng)一性，包括觀察者之間的免疫組織學(xué)檢測的變異性、缺乏確定PD-L1表達情況的標準化抗體以及定義陽性表達的各種臨界值不同。同時，腫瘤細胞中PD-L1的表達在疾病的不同階段可能發(fā)生動態(tài)變化，檢測結(jié)果可能受活檢時間的影響。而且腫瘤具有異質(zhì)性，同一病灶的不同位置，不同病灶之間PD-L1的表達可能是不同的。

PD-L1作為免疫檢查點配體，與細胞毒性T細胞上的PD-1結(jié)合后可造成其功能耗竭，從而協(xié)助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。既往研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中PD-L1的過表達與遠處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，其中包括腎癌、皮膚癌、肺癌和胰腺癌等[18-26]。在頭頸腫瘤中，PD-L1過表達與頭頸腫瘤的預(yù)后關(guān)系尚無一致性結(jié)果[17,27-29]。本研究結(jié)果提示，PD-L1陽性為改善總生存率和疾病特異性生存率的獨立預(yù)后因素(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)。同時，HPV+/PD-L1+患者較 HPV+/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P=0.004)，HPV-/PD-L1+者(DSS,P=0.010;OS,P=0.047) 以及HPV-/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)具有顯著的預(yù)后優(yōu)勢。這種矛盾和不一致性可能與以下原因有關(guān)：(1)病毒相關(guān)腫瘤由病毒相關(guān)癌蛋白致癌，通常腫瘤突變負荷呈低度或中度。病毒感染后出現(xiàn)相關(guān)新抗原，可能引起更強的免疫反應(yīng)，多種病毒相關(guān)腫瘤表現(xiàn)為較強的免疫應(yīng)答及PD-L1過表達[30,31]；(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原激活免疫系統(tǒng)后，腫瘤細胞PD-L1表達上調(diào)，PD-L1表達可能代表先前的內(nèi)源性抗腫瘤免疫反應(yīng)，該反應(yīng)減速但未能完全阻止腫瘤生長，可以使用PD-1/PD-L1抑制劑使之恢復(fù)活力[32]；(3)有研究提示PD-L1過表達機制不同，包括動態(tài)IFNγ或癌基因激活[33,34]，前者IFNγ升高導(dǎo)致的PD-L1過表達為獲得性免疫的一部分，通常與免疫細胞浸潤相關(guān)，表現(xiàn)為局限性過表達[35]；癌基因激活相關(guān)的PD-L1過表達通常缺少淋巴細胞浸潤而呈彌漫性過表達[34,36]。不同機制導(dǎo)致的PD-L1過表達可能與免疫檢查點抑制劑療效不同相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果證實HPV陽性口咽癌較HPV陰性口咽癌患者預(yù)后明顯改善。PD-L1在HPV陽性口咽癌患者表達程度更高，為口咽癌的良好獨立預(yù)后因素，HPV陽性口咽癌患者較好的預(yù)后可能與不同的免疫微環(huán)境有關(guān)。