喉鱗狀細(xì)胞癌中PI3K抑制劑對HMGA1基因表達(dá)的影響

張云龍，宋曉飛，段云靜，趙輝明,趙瑞力，曹云云

(1.石家莊市第一醫(yī)院 a.重癥醫(yī)學(xué)科三病區(qū); b.耳鼻喉科，河北 石家莊050011；2.河北省人民醫(yī)院 耳鼻喉科；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 耳鼻喉科)

喉部原發(fā)性惡性腫瘤中主要為鱗狀細(xì)胞癌，是耳鼻咽喉各部惡性腫瘤中常見類型之一。原癌基因廣泛存在于人類真核細(xì)胞基因組中，在正常情況下不表達(dá)或只低表達(dá)，當(dāng)受到致癌因子激活后可發(fā)生癌基因的活化、點(diǎn)突變，引起過度表達(dá)或表達(dá)異常產(chǎn)物，致細(xì)胞癌變。PI3K生長因子信號通路在胚胎發(fā)育和許多生理過程中起著重要作用，如免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。此通路經(jīng)常在癌組織中激活，可加速細(xì)胞分裂并參與其他信號通路活化，如MAPK、JAK-STAT、 TGFβ，從而在促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和增加治療抵抗行為中發(fā)揮作用[1]。原癌基因HMGA1為一結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與DNA相互作用，重組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，在宮頸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多系統(tǒng)腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)此基因過度表達(dá)[2]。喉鱗狀細(xì)胞癌中此兩種基因相互活化、共同促進(jìn)表達(dá)增加的分子生物學(xué)機(jī)制未見有文獻(xiàn)闡明。本課題組對癌組織及癌旁正常組織，分別用免疫組織化學(xué)SP法檢測PI3K、HMGA1的表達(dá)情況，另采用RT-PCR分組比較ERK抑制劑應(yīng)用人喉癌Hep2細(xì)胞后HMGA1表達(dá)情況，并分析HMGA1基因的表達(dá)和多種臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取石家莊市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2012至2017年行喉癌手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)HE染色后嚴(yán)格篩選，留取標(biāo)本中喉鱗狀細(xì)胞癌47例，癌旁正常組織21例。其中：病理分級依據(jù)2005WHO腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)[3]，高分化(G1、G2)37例，低分化(G3)10例；根據(jù)(UICC)TNM分類標(biāo)準(zhǔn)[4]；臨床分期(Ⅰ、Ⅱ)18例，(Ⅲ、Ⅳ)29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組：N+(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)26例，N0(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)21例；吸煙分組參考Zuo JingJing吸煙與喉癌風(fēng)險關(guān)系[5]，以煙齡(年)×每日吸煙量(支)計數(shù)，陽性(≥400)38例，陰性(<400)9例；解剖分區(qū)：聲門上區(qū)21例，聲門區(qū)26例。

Hep2細(xì)胞為人喉癌細(xì)胞株，取于石家莊市第一醫(yī)院科研中心，將Hep2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(其中含青霉素、鏈霉素100 U/ml),置37℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng)，觀察細(xì)胞長勢2至3天更換培養(yǎng)液，3至5天傳代1次。細(xì)胞融合度70%-80%時更換為無血清培養(yǎng)基12小時后分組備用。

1.2 試劑

免疫組化使用到的關(guān)鍵試劑： PI3K、HMGA1均為鼠抗人單克隆抗體(型號分別為20584-1-AP、Sc-8982)；均為美國Santa Cruz Biotechnology 生產(chǎn)。SP-9002二抗免疫組化試劑盒以及ZLI-9032 DAB顯色液生產(chǎn)廠家為北京中杉金橋生物公司。

RT-PCR 關(guān)鍵試劑：PI3K抑制劑wortmannin(9951s)購自美國Cell Signaling Technology Company，用于提取RNA的TRIzol為美國SBS Co.,ltd生產(chǎn)，RT-PCR 試劑盒生產(chǎn)廠家為美國Promega Co.,ltd，DNA Marker購自北京索來寶科技有限公司，PCR 引物： HMGA1上游引物為(5’→3’) CGGGGCCGACCAAAGGGAAG,下游引物為(5’→3’) CGGTGGGAGCGGAGCAAAGC。GAPDH內(nèi)參：上游引物(5’→3’)AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物(5’→3’)AGGGGTCATTGATGGCAACA。均購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

免疫組化SP法：將收集組織標(biāo)本制作蠟塊并切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、除酶、血清封閉后孵育、沖洗、加一抗、再沖洗后滴加二抗、反復(fù)沖洗后滴加辣根酶工作液、再孵育沖洗后加DAB顯色，后經(jīng)復(fù)染、酚化、氨水返藍(lán)，再次脫水、加二甲苯后封片觀察；PBS液做對照實(shí)驗。RT-PCR方法：將已培養(yǎng)人喉癌Hep2細(xì)胞隨機(jī)分為A、B組，A組為實(shí)驗組，將200 nmol/L wortmannin置細(xì)胞無血清培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)24 h。B組為對照組，所選細(xì)胞置無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；按時收取細(xì)胞，分別提取實(shí)驗組與對照組中RNA，隨后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，將所得產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃8分，95℃45秒， 66℃30秒，72℃25秒，共35次循環(huán)后，置72℃延伸7分鐘。所得的產(chǎn)物放置2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后觀察并與Marker對照，HMGA1所獲得的產(chǎn)物分別為229 bp，GAPDH是104 bp。

1.4 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果參照Fromowitz評分方法[6]：染色強(qiáng)度(intensity，I)分類，其中無染色為0級，弱染色(淺黃)為1級，中染色(棕黃)定為2級，強(qiáng)染色(棕褐) 定為3級；陽性細(xì)胞百分率(percentage，P)分級，陽性細(xì)胞P<5%為0級； 5%≤P<25%為1級，25%≤P<50%為2級，P≥50%為3級。組織學(xué)評分(histologiescore，H)=I×P。若同一標(biāo)本不同區(qū)域存在差別，則取均值評分。當(dāng)分值為0至3分記陰性，為低表達(dá)；分值為4至6分記陽性，為中度表達(dá)；分值為7至9分記強(qiáng)陽性，為高表達(dá)。RT-PCR結(jié)果應(yīng)用Gel work-2ID軟件分析光亮度值，相對表達(dá)量為兩目的基因條帶光密度值與對應(yīng)GAPDH光密度值的比值。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

PI3K蛋白陽性染色相對較深，呈棕褐色，以細(xì)胞質(zhì)為主，少量分布在細(xì)胞核(圖1)。在LSCC組織中陽性率70.2%(33/47)，癌旁組織中,陽性率 33.3%(7/21)。表明PI3K基因在LSCC組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.150，P<0.05)(參見表1)。HMGA1蛋白表達(dá)對應(yīng)的顏色為棕色，散在分布于細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核當(dāng)中(圖2)。在癌組織當(dāng)中，陽性率53.2%(25/47)，在癌旁組織當(dāng)中，陽性率23.8%(5/21)。組間存在顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.083，P<0.05)(表1)。

圖1 PI3K基因在癌旁正常組織及LSCC組織中表達(dá)

圖2 HMGA1基因在癌旁正常組織及LSCC組織中表達(dá)

表1 LSCC及癌旁正常組織中PI3K、HMGA1蛋白表達(dá)

2.2 RT-PCR 檢測結(jié)果

在人喉癌Hep2細(xì)胞中分別檢測加用PI3K抑制劑的實(shí)驗組及不加抑制劑的對照組中HMGA1 mRNA水平表達(dá)(圖3)，表達(dá)量實(shí)驗組為(0.59±0.27)；對照組為(0.18±0.17)，實(shí)驗組與對照組對比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) (表2)。

圖3 RT-PCR檢測實(shí)驗組與對照組中HMGA1mRNA水平表達(dá)電泳圖像，其中單數(shù)(1、3、5、7)為實(shí)驗組電泳圖，雙數(shù)(2、4、6、8)為對照組電泳圖

2.3 LSCC組織中HMGA1基因蛋白表達(dá)在多個臨床病理參數(shù)組內(nèi)對比情況(表3)

臨床分期組內(nèi)對比分析差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),另外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及吸煙組內(nèi)對比分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但年齡、病理分級、解剖分區(qū)組內(nèi)對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

磷脂酰肌醇3激酶為脂質(zhì)激酶家族中的一類，其通過在細(xì)胞內(nèi)傳遞級聯(lián)信號調(diào)控多種生物過程。在癌組織中PI3K可通過多種機(jī)制被激活，PI3KCA基因編碼p110α亞基自身突變，激活的受體酪氨酸激酶如EGFR、HER2和PDGFR參與PI3K通路，直接與RAS通路結(jié)合互相活化，PTEN(一種與PI3K功能相反，并能降解PI3K產(chǎn)物的激酶)磷酸化失活等。因此推測PI3K信號通路為癌癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵核心通路之一[7]。HMGA1為一種癌胚基因，高表達(dá)于組織胚胎時期，沉默于不再發(fā)育的成年細(xì)胞中，但多種惡性腫瘤中表達(dá)再次活躍。此基因為一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，能重組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)不同組織中轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA之間相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡抑制等行為，并能夠參與EGFR、Hippo、Ras/ERK、Akt等多個通路激活促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[8]。

表2 實(shí)驗組與對照組中HMGA1 mRNA的表達(dá)

表3 LSCC中HMGA1蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)在LSCC組織中PI3K、HMGA1蛋白水平表達(dá)相比癌旁組織均明顯升高，經(jīng)對比分析，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。提示PI3K、HMGA1在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮一定作用。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在卵巢癌中普遍存在。EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期事件，鈣相關(guān)信號通路PI3K/Akt激活是癌癥進(jìn)行過程中EMT發(fā)揮作用的關(guān)鍵步驟，而瞬時受體電位離子通道(TRPM7)對二價陽離子有高度滲透性，可提高如鈣離子、鎂離子水平。由此推測TRPM7可通過調(diào)節(jié)鈣離子水平激活PI3K/Akt信號通路，導(dǎo)致卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移增加。Md.Zahid Akhter等[10]應(yīng)用抗癌藥物ADM(阿霉素)處理的實(shí)驗細(xì)胞，c-myc mRNA表達(dá)水平呈時間依賴性下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)ADM處理的宮頸癌HeLa細(xì)胞系中HMGA1蛋白和mRNA水平表達(dá)下降，提示HMGA1過表達(dá)與細(xì)胞惡變、癌癥進(jìn)展有關(guān)。

Jing Zhong等[11]在進(jìn)行甲狀腺癌細(xì)胞中TGF-β1對HMGA1表達(dá)影響的實(shí)驗中，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA isolation和RT-PCR方法檢測PI3K/Akt通路抑制劑(wortmannin)處理的甲狀腺癌SW579細(xì)胞中HMGA1轉(zhuǎn)錄降低，免疫熒光染色方法對比分析顯示PI3K/Akt通路(wortmannin)可阻止TGF-β1誘導(dǎo)的HMGA1表達(dá)增強(qiáng)，由此可推測甲狀腺癌SW579細(xì)胞中TGF-β1通過刺激PI3K/Akt通路活化誘導(dǎo)HMGA1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Liau等[12]將PIRES-HMGA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胰腺導(dǎo)管癌MiaPaCa2細(xì)胞與不同濃度的PI3K抑制劑組合行軟瓊脂實(shí)驗，結(jié)果顯示：加入PI3K抑制劑后，與未轉(zhuǎn)染的空白pIRES-puro3對照組相比，實(shí)驗組中，接受轉(zhuǎn)染的MiaPaCa2細(xì)胞復(fù)制水平顯著降低。表明PI3K可調(diào)控HMGA1促進(jìn)腫瘤發(fā)生。這些結(jié)論均與本實(shí)驗研究結(jié)果“應(yīng)用PI3K通路抑制劑后檢測喉癌細(xì)胞HMGA1mRAN表達(dá)量明顯減少”一致。

LSCC組織中HMGA1在表達(dá)蛋白水平：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組與N0組對比組間的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義)、臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期分組組間對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義)，吸煙(陽性組與陰性組對比組間的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義)。而病理分級組內(nèi)對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Mendez等[13]針對乳腺癌分子機(jī)制研究時發(fā)現(xiàn)三陰乳腺癌(TNBC)細(xì)胞中HMGA1過表達(dá)，并且HMGA1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)定位的改變預(yù)示著TNBC原發(fā)性腫瘤的侵襲性增強(qiáng)。應(yīng)用HMGA1阻斷抗體后，體外實(shí)驗中TNBC腫瘤的侵襲性減弱，免疫實(shí)驗中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率降低。實(shí)驗結(jié)論強(qiáng)烈建議將HMGA1作為預(yù)測TNBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。另外Qin[14]研究發(fā)現(xiàn)相比永生化的人類泌尿上皮細(xì)胞系SV-HUC-1，膀胱癌細(xì)胞株T24和5637中表達(dá)低水平的let-7i和高水平的HMGA1，應(yīng)用let-7i質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的T24和5637細(xì)胞系中，檢測HMGA1蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，并表現(xiàn)出細(xì)胞增殖和遷移明顯降低。結(jié)果表明：以抑制HMGA1靶基因表達(dá)為目的，上調(diào)let-7i，可減弱人類膀胱癌細(xì)胞株T24和5637的增殖和遷移。綜合以上兩篇文獻(xiàn)正反方面研究，結(jié)合本實(shí)驗結(jié)果可推斷HMGA1在促進(jìn)喉鱗癌浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。本實(shí)驗結(jié)果：吸煙(陽性組高于陰性組)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。提示HMGA1在吸煙促進(jìn)喉癌發(fā)生中起到一定作用。相關(guān)文獻(xiàn)為Credico等[15]對匯總了國際頭頸癌流行病學(xué)聯(lián)盟(INHANCE)的18260例頭頸惡性腫瘤(包括喉癌)和29844例對照病例行33項病例對照研究，評估吸煙強(qiáng)度、吸煙時間和頭頸癌之間的量效關(guān)系，結(jié)果表明：吸煙與喉癌風(fēng)險之間在劑量-反應(yīng)和時間-反應(yīng)上的顯著正相關(guān)性。結(jié)合本研究結(jié)果目前認(rèn)為喉癌的主要危險因素是吸煙，吸煙與喉癌發(fā)生關(guān)系更為密切一致。

人們在研究腫瘤的致病因素過程中逐漸意識到PI3K、HMGA1這兩種基因的重要性。本次研究結(jié)果顯示，PI3K以及HMGA1在喉鱗癌組織當(dāng)中的基因發(fā)生了明顯的表達(dá)升高，并且它們之間的激活也呈現(xiàn)出正相關(guān)性，表明此兩種基因能夠利用類似的方法并相互影響對喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定促進(jìn)作用，對PI3K、HMGA1表達(dá)水平的檢測可以為喉癌的診斷、進(jìn)展及預(yù)后提供重要參考價值，同時也可為基因靶向治療提供可參考靶點(diǎn)。