胰腺癌組織c-MET表達(dá)與循環(huán)miR-34a、miR-449水平的相關(guān)性

何春華 董來(lái)榮 沈亦鈺 王曉光

嘉興醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科，嘉興 314000

微小RNA(microRNA, miRNA)在腫瘤疾病診治中的價(jià)值受到越來(lái)越多的重視。由于miRNA具有表達(dá)時(shí)序性和組織特異性，外周血中的含量在疾病發(fā)展的某一階段亦相對(duì)穩(wěn)定，因此miRNA是一種頗具潛力的腫瘤標(biāo)志物[1-2]。間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-mesenchymal epithelial transition factor, c-MET)是原癌基因MET編碼的蛋白，是胰腺癌重要的預(yù)后因子，高水平的c-MET往往提示患者預(yù)后不良[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，c-MET存在miR-34a和miR-449結(jié)合位點(diǎn)，且這兩個(gè)miRNA都是公認(rèn)的抑癌基因[5]。本研究旨在探討胰腺癌組織c-MET的表達(dá)與循環(huán)miR-34a和miR-449水平的相關(guān)性，為胰腺癌的診治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年3月至2017年3月間嘉興醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的41例胰腺癌患者的臨床資料，其中男性23例，女性18例；年齡43～75歲，中位年齡63歲，平均年齡64歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌；(2)保存手術(shù)切除的胰腺癌組織及其匹配的經(jīng)病理證實(shí)的癌旁正常胰腺組織；(3)保存手術(shù)前和手術(shù)后3個(gè)月首次復(fù)查的肝素抗凝的全血樣本；(4)臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)前有放化療和免疫靶向治療等其他療法干預(yù)史；(2)術(shù)后隨訪時(shí)間不足2年；(3)隨訪期內(nèi)發(fā)生其他惡性腫瘤者；(4)合并糖尿病或傳染病者。記錄患者的年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index, BMI)及腫瘤部位、大小、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。所有患者完成>2年的隨訪，統(tǒng)計(jì)病死率。

二、胰腺癌組織c-MET表達(dá)檢測(cè)

取甲醛固定的胰腺癌及癌旁正常胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，由病理科醫(yī)師閱片。另取石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織c-MET表達(dá)。兔抗人c-MET一抗(ab252205，Abcam)工作濃度1∶50，山羊抗兔二抗(ab205718，Abcam)工作濃度1∶2 000，最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，中性樹膠封固。由病理科醫(yī)師閱片，胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為c-MET陽(yáng)性，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例(1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分)及染色強(qiáng)度(無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分，黃褐色為4分)進(jìn)行評(píng)分，兩分相加≥4分為c-MET陽(yáng)性。

三、循環(huán)miR-34a、miR-449提取及檢測(cè)

取術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療及術(shù)后3個(gè)月首次復(fù)查時(shí)的空腹肘靜脈血，加入肝素抗凝的試管，混均后置-80℃無(wú)菌存儲(chǔ)。應(yīng)用miRNA快速提取試劑盒提取和純化循環(huán)miRs，采用熒光定量PCR法測(cè)定循環(huán)miR-34a、miR-449水平。先逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，再應(yīng)用熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增生成miR-34a或miR-449，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。 miR-34a、miR-449及內(nèi)參U6引物序列見表1，引物由上海生工生物技術(shù)工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)程序：95℃ 60 s，95℃ 30 s、60℃ 30 s、2℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算miR的表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 靶向 miR-34a、miR-449、U6的引物序列

結(jié) 果

一、胰腺癌組織c-MET表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胰腺癌組織c-MET陽(yáng)性表達(dá)率為63.4%(26/41)，癌旁正常胰腺組織的c-MET陽(yáng)性表達(dá)率為24.4%(10/41)，胰腺癌組織明顯高于癌旁正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.676，P=0.000)。胰腺癌組織c-MET陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、BMI及腫瘤部位、分化程度均無(wú)相關(guān)性，但與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，即c-MET陽(yáng)性患者TNM Ⅲ/Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均明顯高于c-MET陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

二、胰腺癌組織c-MET表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

c-MET陽(yáng)性與c-MET陰性患者的生存率分別為38.5%和53.3%，中位生存期分別為29.5個(gè)月和35.0個(gè)月；無(wú)進(jìn)展生存率分別為19.2%和40.0%，無(wú)進(jìn)展中位生存期分別為24個(gè)月和33個(gè)月。c-MET陽(yáng)性患者的生存率及無(wú)進(jìn)展累積生存率均較c-MET陰性患者明顯縮短，病死率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

三、胰腺癌組織c-MET表達(dá)與循環(huán)miR-34a、miR-449水平的關(guān)系

術(shù)前c-MET陽(yáng)性患者循環(huán)miR-34a與miR-449水平較c-MET陰性患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后兩組患者循環(huán)miR-34a水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但c-MET陽(yáng)性患者miR-449水平低于c-MET陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

四、術(shù)前循環(huán)miR-34a、miR-449水平對(duì)胰腺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

術(shù)前循環(huán)miR-34a、miR-449水平對(duì)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及預(yù)后均有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值(圖2，表4)。

表2 胰腺癌組織c-MET表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：c-MET為間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子；BMI為體重指數(shù)

注：c-MET為間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子

圖1c-MET陽(yáng)性與陰性的胰腺癌患者生存曲線(1A)和無(wú)進(jìn)展生存曲線(1B)

表3 胰腺癌組織c-MET陽(yáng)性與陰性患者手術(shù)前后循環(huán)miR-34a、miR-449水平的比較

注：c-MET為間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子

圖2 循環(huán)miR-34a、miR-449水平預(yù)測(cè)腫瘤Ⅲ/Ⅳ期(2A)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(2B)及隨訪期患者死亡(2C)的ROC曲線

表4 循環(huán)miR-34a、miR-449水平預(yù)測(cè)胰腺癌病情和預(yù)后的ROC曲線分析

討 論

miRNA不具有蛋白翻譯功能，主要依靠錨定mRNA來(lái)發(fā)揮生物學(xué)活性，與抑癌基因結(jié)合可發(fā)揮促癌作用，與原癌基因結(jié)合可發(fā)揮抑癌作用。Li等[6]報(bào)道，miR-155-5p靶向結(jié)合腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Yan等[7]報(bào)道，miR-629靶向結(jié)合FOXO3促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。張宏偉和王彩茹[8]報(bào)道，miR-222靶向調(diào)控PTEN表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。吳翔等[9]報(bào)道，胰腺導(dǎo)管腺癌miR-21與TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道，RNA結(jié)合蛋白STAT3能促進(jìn)肺癌細(xì)胞生成miR-34a，使細(xì)胞周期停滯在G期[10]；miR-34a可調(diào)控酪氨酸激酶受體2，抑制癌細(xì)胞的耐藥[11]；SNHG7通過(guò)調(diào)節(jié)miR-34a-Snail-EMT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力[12]；miR-449a靶向調(diào)節(jié)c-MET抑制Hela細(xì)胞的遷移及侵襲能力[13]。這些研究結(jié)果支持miR-34a、miR-449具有抑癌作用。

c-MET能夠特異性與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)結(jié)合，參與多種腫瘤性疾病的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。王玲[16]從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Oncomine、cBioportal、GEPIA等)收集胰腺癌c-MET表達(dá)的有關(guān)論文，證實(shí)c-MET在胰腺癌組織顯著高表達(dá)。c-MET抑制劑用于抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)研究也已取得了一定的進(jìn)展[17]，表明c-MET是一種原癌基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織c-MET蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常胰腺組織，c-MET陽(yáng)性患者的TNM分期以Ⅲ/Ⅳ期居多，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，生存時(shí)間更短，病死率更高，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，治療前c-MET陽(yáng)性患者的循環(huán)miR-34a、miR-449水平明顯低于c-MET陰性患者，手術(shù)后循環(huán)miR-34a、miR-449水平均明顯回升，術(shù)前循環(huán)miR-34a、miR-449水平對(duì)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，均提示c-MET與miR-34a、miR-449之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。c-MET可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物展開深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突