胰腺腫瘤的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究模型

郭世偉

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院胰腺肝膽外科，上海 200433

【提要】 在多種癌癥治療取得突破的今天，胰腺癌治療藥物的研發(fā)仍舉步維艱，缺少能反映腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和模擬其復(fù)雜微環(huán)境的模型是導(dǎo)致從基礎(chǔ)到臨床轉(zhuǎn)化研發(fā)失敗的重要原因。隨著類器官、人源腫瘤異種移植和人源化小鼠等技術(shù)的出現(xiàn)，使個(gè)體化精準(zhǔn)研究腫瘤異質(zhì)性、高度模擬包含間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境成為可能。利用這些新技術(shù)開展胰腺癌的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究可以彌補(bǔ)既往研究手段的不足，有可能建立適用于胰腺癌研究的精準(zhǔn)模型，推動(dòng)胰腺癌治療藥物的研發(fā)，改善胰腺癌的療效。

2020年1月8日《CA Cancer Journal for Clinicians》[1]發(fā)布了美國癌癥統(tǒng)計(jì)的最新數(shù)據(jù)，美國癌癥病死率出現(xiàn)歷史上大幅年度下降(2.2%)，是自1930年以來下降幅度最大的一次，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌四大常見癌癥病死率穩(wěn)步下降，黑色素瘤病死率下降幅度甚至達(dá)到了7%。究其原因，在危險(xiǎn)因素防控的基礎(chǔ)上有效治療藥物的出現(xiàn)是其決定因素。黑色素瘤治療的突破要?dú)w功于新獲批的多種療法，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑Yervoy (ipilimumab)、Opdivo (nivolumab)、Keytruda (pembrolizumab) ，靶向療法BRAF抑制劑Zelboraf(vemurafenib)等[2-4]。然而上述突破性療法，包括靶向治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、細(xì)胞治療和質(zhì)子重離子等在胰腺癌的臨床治療試驗(yàn)中均以失敗告終[5]；另一方面，大量通過傳統(tǒng)基礎(chǔ)研究模型篩選的藥物往往在臨床前動(dòng)物模型驗(yàn)證中即以失敗告終[6]。這些都導(dǎo)致了胰腺癌無藥可用，無法可醫(yī)，死亡人數(shù)接近發(fā)病人數(shù)，被認(rèn)為是惡性程度最高的腫瘤。因此，探索究竟是哪些因素導(dǎo)致了目前治療的失敗成為胰腺腫瘤基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究的重要方向。

一、胰腺腫瘤復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制決定了現(xiàn)有研究策略的失效

目前研究認(rèn)為，胰腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制明顯區(qū)別于其他腫瘤，導(dǎo)致其惡性程度高的特性主要集中于以下三個(gè)方面。

1．腫瘤細(xì)胞來源多樣，惡變機(jī)制復(fù)雜：目前經(jīng)典的胰腺癌發(fā)生模型認(rèn)為腫瘤來源于導(dǎo)管上皮，早期病變?yōu)橐认偕掀?nèi)腫瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)，根據(jù)病變不典型增生程度可逐級(jí)分為扁平黏液上皮(PanIN-1A)到原位癌(PanIN-3)[7]，即胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞從正常演變到PanIN直至浸潤性癌的過程，同時(shí)伴隨K-ras、CDKN2A、SMAD4、TP53基因的突變。癌基因K-ras突變被認(rèn)為是早期事件(PanIN-1A階段突變率35%， PanIN-1B 43% ，PanlN-3 100%)，CDKN2A突變出現(xiàn)在PanIN-2，而SMAD4、TP53基因失活出現(xiàn)在后期[8-9]。然而臨床研究的結(jié)論卻與之不符。Guerra等[10]和Ji等[ 11]發(fā)現(xiàn)胰腺癌可來源于腺泡細(xì)胞，F(xiàn)erreira等[12]證明通過癌基因AGR2可區(qū)分胰腺腫瘤的細(xì)胞來源，大部分胰腺癌來源于腺泡細(xì)胞發(fā)生導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化(acinar-ductal metaplasia, ADM)。而臨床上90%的PDAC患者可檢測(cè)出K-ras突變，只有60%的患者可檢出TP53突變[13]。Notta等[14]發(fā)現(xiàn)60%的胰腺癌細(xì)胞在有絲分裂過程中曾經(jīng)出現(xiàn)過染色體碎裂(chromothripsis)，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的基因突變不是依次發(fā)生而是同時(shí)產(chǎn)生，從而顛覆性認(rèn)為胰腺癌的發(fā)生過程可能不是一個(gè)漸進(jìn)的過程，大量的基因變異可以通過一次或少數(shù)幾次有絲分裂過程中的錯(cuò)誤而爆炸性地產(chǎn)生，從而造成胰腺癌高度惡性，最終導(dǎo)致不同胰腺腫瘤間存在極大的異質(zhì)性，即生物行為差異明顯。以上假說使得胰腺癌分子分型研究在經(jīng)歷多篇《Nature》文章論證后又回到了基于RNA表達(dá)分型的兩分法上[15-17]，難以指導(dǎo)目前的臨床個(gè)體化治療。目前臨床獲益的只是具有遺傳BRCA突變，且鉑類化療無進(jìn)展的近1%的患者[18]。因此，在針對(duì)K-ras和TP53突變的有效治療出現(xiàn)前，類似肺癌以針對(duì)單一驅(qū)動(dòng)基因治療腫瘤的方案在胰腺癌上難以突破。

2．間質(zhì)成分大量增生，作用因時(shí)而異：大量的間質(zhì)增生是胰腺癌區(qū)別于其他實(shí)體腫瘤的另一大特征。在經(jīng)典的胰腺癌病理形態(tài)中腫瘤細(xì)胞只占20%～50%，而剩余的由增生的間質(zhì)細(xì)胞及其分泌的基質(zhì)組成[19]。這些間質(zhì)使得腫瘤局部壓力增高，缺血缺氧，導(dǎo)致腫瘤局部微環(huán)境復(fù)雜，化療藥物很難通過，是造成胰腺癌治療效果差的重要原因。臨床和基礎(chǔ)研究都證實(shí)間質(zhì)作用復(fù)雜，盲目去除間質(zhì)反而會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。2014年兩篇《Cancer Cell》雜志的研究分別證明間質(zhì)成分可以限制而不是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，刪除腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast, CAF，SMA+)會(huì)減輕纖維化導(dǎo)致的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制，并加速腫瘤進(jìn)展[20-21]。可有效抑制胰腺星狀細(xì)胞激活的Hedgehog通路抑制劑IPI-926(saridegib)的Ⅱ期臨床研究(NCTO1130142)結(jié)果顯示，IPI-926與吉西他濱聯(lián)用后患者生存期反而更短，不良反應(yīng)發(fā)生率更高[22]。用KPGC模型小鼠進(jìn)行的透明質(zhì)酸酶(PEGPH20)研究在聯(lián)合AG化療方案取得陽性結(jié)果后[23]，聯(lián)合FOLFIRINOX方案治療卻導(dǎo)致了患者更短的生存期[24]。相反，臨床取得成功的AG化療方案曾被歸因于可以和SPARC蛋白結(jié)合清除纖維間質(zhì)并增加吉西他濱的灌注，然而最近的研究卻發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白的表達(dá)并不能預(yù)測(cè)AG方案的療效，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明和SPARC蛋白表達(dá)無關(guān)，提示AG方案的有效與“去間質(zhì)化”并不直接相關(guān)[25]。以上結(jié)果都說明胰腺腫瘤中CAF是一個(gè)復(fù)雜的、有多種細(xì)胞來源的混合體，部分成分(SMA+)可能主要起抑制腫瘤作用[26]，部分成分(FAP+、FAK+、POSTN+)可能起促進(jìn)腫瘤作用，在不同階段、不同藥物治療過程中扮演的角色也不同[27]。因此，在進(jìn)一步明確各種來源的CAF在胰腺腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具體作用之前，盲目針對(duì)間質(zhì)的治療可能會(huì)產(chǎn)生臨床難以解釋的結(jié)論，干擾胰腺癌治療藥物的研究。

3．免疫逃逸機(jī)制不明，常規(guī)阻斷無效：雖然PDAC通常被研究者歸為“冷腫瘤”，但如果除去大量增生的間質(zhì)區(qū)域，在腫瘤細(xì)胞周圍可以觀察到各種免疫細(xì)胞的大量浸潤[28]，其中腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)比例偏少，而與免疫抑制相關(guān)的巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils，TANs)、骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells， MDSCs)、調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)、調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞(regulatory B cells，Bregs)較多[29]。這些細(xì)胞的免疫抑制機(jī)制主要包括上調(diào)抗腫瘤免疫細(xì)胞的免疫抑制受體，如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic tlymphocyte-associateda ntigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受體1(programmed death 1, PD-1)表達(dá)；分泌免疫抑制性可溶性介質(zhì)，如 IL-10、TGF-β;抑制免疫細(xì)胞對(duì)必需代謝底物(如色氨酸、精氨酸)的利用等[30]。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)這些免疫抑制細(xì)胞在胰腺癌中發(fā)揮的功能卻很復(fù)雜?！禖ancer Discovery》的研究發(fā)現(xiàn)，單純Treg細(xì)胞的刪除會(huì)改變腫瘤微環(huán)境并加速胰腺癌變[31]。臨床研究也證實(shí)，可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡并降低抑制性信號(hào)的CTLA-4單克隆抗體在胰腺癌患者中無效[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從癌前病變到晚期PDAC Treg水平逐步增加，癌旁小劑量 CTLA-4 單克隆抗體干預(yù)可有效減小腫瘤體積，而加大劑量后并未增加其抑瘤效果卻增加了次級(jí)淋巴節(jié)Treg細(xì)胞的浸潤，抵消了CTLA-4單克隆抗體抗腫瘤治療的作用[33]。PD-1治療只在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的少數(shù)胰腺癌(<2%)中發(fā)揮作用[34]。同樣被寄予厚望的針對(duì)IL-10的SEQUOIA在胰腺癌三期臨床治療中以失敗告終[35]。這些結(jié)果都表明免疫微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的整體，單純抑制或拮抗某一類細(xì)胞無法解除整體免疫抑制。

因此，胰腺腫瘤需要一個(gè)復(fù)雜的三元n次方程來破解，腫瘤因素(a1,a2,a3……)+間質(zhì)因素(b1,b2,b3……)+免疫因素(c1,c2,c3……)=高惡性生物學(xué)行為(Y)。

二、新研究模型的出現(xiàn)給腫瘤基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究帶來希望

既往抗腫瘤藥物篩選模型已無法滿足目前個(gè)體化腫瘤治療的需要。2016年《Nature》雜志報(bào)道，美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)宣布，被研究人員使用達(dá)25年的抗癌藥物測(cè)試的癌細(xì)胞樣本群(NCI-60)即將“退休”[36]。主要是因?yàn)檫@些細(xì)胞系多來自惡性程度較高的腫瘤或者轉(zhuǎn)移灶，再加上歷經(jīng)幾千代的培養(yǎng)，細(xì)胞的基因組和行為均發(fā)生了改變，難以反映臨床腫瘤真實(shí)特性[37]。而取而代之，條件重編程細(xì)胞(conditional reprogramming cell，CRC)、類器官(organoid)和人源腫瘤異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)被認(rèn)為是最有希望用于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究的3種技術(shù)。目前類器官和PDX技術(shù)已初步證明可行。

類器官是指在體外由組織細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)得來的3D細(xì)胞團(tuán)，具有自我更新、自我組織的能力，且有與原組織相似的功能[38]。類器官最初應(yīng)用于對(duì)體外正常組織器官的培養(yǎng)，是傳統(tǒng)體外2D培養(yǎng)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭g的橋梁。相比于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)，類器官無論是在組成成分還是組織結(jié)構(gòu)上都更貼近于來源組織；相比于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，類器官可以?yīng)用各類藥物和干預(yù)措施，研究組織器官發(fā)育及用于組織器官的移植和修復(fù)[39]。更重要的是，利用該技術(shù)構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞類器官可在體外真實(shí)立體模擬腫瘤和微環(huán)境中細(xì)胞的交互作用，真實(shí)反映藥物的作用方式，甚至可以應(yīng)用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜔o法耐受的藥物[40]。同時(shí)還可以對(duì)類器官應(yīng)用基因工程技術(shù)(CRISPR-Cas9等)改造某些目的基因，從而研究該類基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的作用[41]。這些特點(diǎn)都決定了通過腫瘤類器官進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選候選藥物，較細(xì)胞系等具有時(shí)間短、耗費(fèi)低、結(jié)果準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)，為腫瘤的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究提供重要工具。

PDX是將人的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，依靠小鼠提供的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需活體環(huán)境而建成的動(dòng)物模型[42]。該模型可以高度保留患者腫瘤的組織學(xué)特性、遺傳學(xué)特征以及腫瘤特異性，同時(shí)也保留了一部分腫瘤微環(huán)境信息，包括成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)，但缺少免疫細(xì)胞，因此能較好地反映腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境之間復(fù)雜的相互關(guān)系，使其在模擬人體腫瘤組織生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[43]。早期由于免疫缺陷小鼠構(gòu)建的不完全，加上復(fù)雜的操作步驟及高昂的成本， 使PDX應(yīng)用受到極大限制。而在NCI提出轉(zhuǎn)型后，全球已經(jīng)加緊PDX庫建設(shè)，NCI初期目標(biāo)是建立1 000個(gè)PDX模型，并將這些小鼠體內(nèi)培養(yǎng)的人類腫瘤細(xì)胞提供給研究者，其中還包括每個(gè)腫瘤的基因組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)。EurOPDX就是由16個(gè)歐洲機(jī)構(gòu)聯(lián)合組成的PDX模型庫，旨在建立和發(fā)展臨床相關(guān)和標(biāo)注的PDX網(wǎng)絡(luò)庫，據(jù)稱已經(jīng)擁有1 500個(gè)PDX模型[44]；美國的杰克遜實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有超過450個(gè)PDX模型。冠科生物科技(Crown Bioscienc)、諾華等國際制藥巨頭也紛紛采用PDX模型進(jìn)行抗腫瘤藥物研究。目前很多不同腫瘤類型的臨床試驗(yàn)已證明基于PDX模型與臨床患者的藥物反應(yīng)相關(guān)性可達(dá)90%[45]。由于相同基因組特征的PDX模型可以被反復(fù)利用，使其在靶向藥物研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。再加上PDX模型是目前認(rèn)為在體外最接近真實(shí)腫瘤環(huán)境的動(dòng)物模型，已經(jīng)成為目前化療和靶向藥物研發(fā)的不二選擇。

人源化腫瘤異種移植模型(humanized PDX cancer models, hu-PDX)是通過在NSG小鼠上重建人的免疫系統(tǒng)，然后再接種人的腫瘤，來評(píng)價(jià)腫瘤免疫治療效果的模型[46]。用于建立PDX模型的小鼠根據(jù)免疫缺陷程度可以分為BALB/c-Nude、SCID、NOD/SCID、NSG及NCG小鼠。其中NSG、NCG小鼠不但缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞，而且細(xì)胞因子信號(hào)傳遞能力缺失，對(duì)人源細(xì)胞和組織幾乎沒有排斥反應(yīng)，因此也可以重建人的血液和免疫系統(tǒng)[47]。通常在小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)的方法包括：(1)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)人源化小鼠，即將人PBMC移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，但PBMC小鼠只有T細(xì)胞功能，缺乏樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)功能，因此無法用于評(píng)價(jià)多肽及RNA類腫瘤個(gè)性化疫苗[48]；(2)CD34人源化小鼠，即將人臍帶血來源的CD34+造血干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，人造血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可分化為T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞類型，因此CD34+人源化小鼠免疫系統(tǒng)功能更完全，目前已經(jīng)被廣泛用于HIV等感染性病毒的機(jī)制研究及臨床評(píng)價(jià)中[49]。隨著腫瘤免疫療法研究熱度不斷提升，美國JAX實(shí)驗(yàn)室及Crown Bio公司等也在CD34+人源化小鼠中移植人腫瘤細(xì)胞系，用于評(píng)價(jià)PD-1等免疫檢查點(diǎn)抗體藥物的藥效[50]。這一突破使得利用人源化小鼠評(píng)價(jià)免疫治療成為可能，彌補(bǔ)了PDX模型免疫治療評(píng)估的最大短板，成為目前少有的能在體外活體模擬評(píng)價(jià)人腫瘤免疫治療的模型，有望成為未來免疫治療個(gè)體化評(píng)估的模型。

以上3種模型最大的優(yōu)點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞來源于高度個(gè)體化的腫瘤患者，極大程度保證了腫瘤異質(zhì)性的反應(yīng)，同時(shí)盡可能保留了腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)和免疫成分，無論對(duì)于胰腺腫瘤的基礎(chǔ)研究還是轉(zhuǎn)化研究都是非常重要和必須的，也只有依賴這樣特殊的模型，胰腺癌的研究才有可能擺脫既往低效和無用的傳統(tǒng)，真正給胰腺癌的治療帶來希望。

三、新模型在胰腺癌研究中的應(yīng)用

1．類器官：2013年，Clevers團(tuán)隊(duì)率先利用來自小鼠胰腺的組織細(xì)胞在以RSPO1為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽囊樣結(jié)構(gòu)，并可以誘導(dǎo)其分化為導(dǎo)管細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，被認(rèn)為是最早的胰腺組織類器官[51]。2015年1月Clevers團(tuán)隊(duì)在《Cell》雜志上率先報(bào)道胰腺腫瘤類器官可以從切除或活檢腫瘤組織中快速建立并長(zhǎng)期保存，并表現(xiàn)出導(dǎo)管樣病變和腫瘤不同階段的特異性[52]。2015年10月 Muthuswamy團(tuán)隊(duì)在《Nature Medicine》雜志首次報(bào)道在類器官上證實(shí)K-ras和TP53突變可以導(dǎo)致正常胰腺細(xì)胞癌變，并預(yù)測(cè)腫瘤類器官可用于藥物篩選和個(gè)體化治療[53]。2018年5月Tuveson團(tuán)隊(duì)在《Cancer Discovery》首次報(bào)道構(gòu)建了規(guī)?；囊认侔╊惼鞴賻?，并系統(tǒng)評(píng)估了常用化療藥物在類器官和人群間反應(yīng)的相關(guān)性，最終找出了可以用于臨床藥效預(yù)測(cè)的表達(dá)譜[54]。2019年11月 Clevers團(tuán)隊(duì)再次在《PNAS》雜志報(bào)道了胰腺癌類器官庫用于臨床前潛在有效藥物庫篩選的研究，發(fā)現(xiàn)了一些目前臨床上尚未試用的敏感藥物，并強(qiáng)調(diào)了個(gè)體化方法對(duì)癌癥有效治療的重要性[55]。以上多個(gè)重量級(jí)的研究證實(shí)胰腺類器官體外培養(yǎng)的可行性，并證明了其在臨床轉(zhuǎn)化研究中的優(yōu)勢(shì)。另外一些學(xué)者則在嘗試不斷完善胰腺類器官模型，以便應(yīng)用于更多的研究。2018年3月Seino等[56]在《Cell Stem Cell》上報(bào)道了胰腺腫瘤類器官和不同間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，應(yīng)用該模型確定了兩種可逆的CAF亞型，成功揭示腫瘤和不同間質(zhì)細(xì)胞的交互作用。2019年2月Tuveson團(tuán)隊(duì)在《Cancer Discovery》上報(bào)道使用類器官和小鼠模型確定腫瘤分泌的TGF-β和IL-1是促進(jìn)CAF異質(zhì)性的重要配體，證明IL-1誘導(dǎo)LIF表達(dá)和下游JAK/STAT活化，產(chǎn)生炎癥性CAFs，TGF-β通過下調(diào)IL-1受體表達(dá)和促進(jìn)向肌成纖維細(xì)胞分化來拮抗這一過程，為抗間質(zhì)治療提供了策略[57]。而 James團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上加入了免疫細(xì)胞，形成了腫瘤細(xì)胞、CAF和免疫細(xì)胞共存的最接近活體情況的類器官模型，并在其中評(píng)價(jià)了免疫檢查點(diǎn)阻斷治療效果，為胰腺癌體外類器官模型做出了有意義的探索[58]。

2．PDX：腫瘤特性和所使用免疫缺陷小鼠的類型是影響PDX建模成功率的主要因素。2011年Garrido-Laguna團(tuán)隊(duì)利用裸小鼠進(jìn)行皮下移植的69例胰腺癌成功率為61%[59]，2013年Mattie團(tuán)隊(duì)利用SCID小鼠進(jìn)行皮下移植的12例成功率為67%[60]，2019年筆者所在課題組利用NSG小鼠進(jìn)行皮下移植的121例成功率達(dá)71.1%[61]。進(jìn)而，多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用胰腺癌PDX高成瘤率的特點(diǎn)進(jìn)行了廣泛的臨床前藥物篩選和個(gè)體化治療研究。早在2006年Viqueira團(tuán)隊(duì)就建立了一個(gè)胰腺腫瘤PDX平臺(tái)來測(cè)試一些具有轉(zhuǎn)化前景的藥物，并報(bào)道了表皮生長(zhǎng)因子受體和磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)與某些藥物反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)[62]。2008年Smith團(tuán)隊(duì)使用了Freiburg PDX庫(由400個(gè)裸鼠皮下生長(zhǎng)的人類腫瘤模型組成)測(cè)試吉西他濱和抗VEGF抗體(HuMV833)的藥效[63]。2015、2016年Lohse團(tuán)隊(duì)利用PDX小鼠研究了聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制劑olaparib(AXD-2281)對(duì)BRCA1/ BRCA2突變胰腺癌放化療敏感性影響的研究，證明其對(duì)鉑類更敏感[64-65]。另外一系列針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物drozitumab[66]和AZD7762(Chk1抑制劑)[67]先后在PDX模型上被證實(shí)可以抑制胰腺腫瘤生長(zhǎng)。此外，腫瘤間質(zhì)對(duì)藥效影響的評(píng)估也成為PDX的另一重要用途。2011年Von Hoff團(tuán)隊(duì)利用裸鼠構(gòu)建了一個(gè)被稱為PancXenoBank的PDX平臺(tái)，利用該平臺(tái)發(fā)現(xiàn)吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇能顯著減少腫瘤組織中的間質(zhì)含量，進(jìn)而提高腫瘤組織中吉西他濱的濃度(2.8倍)，該方案成為目前胰腺癌治療最有效的方案之一[68]。Valles團(tuán)隊(duì)利用NOD/SCID小鼠PDX模型測(cè)試了Ibrutinib(PCI-32765，BTK抑制劑)抑制纖維炎癥反應(yīng)的作用[69]。 Rajeshkumar等[70]甚至利用PDX模型研究了苯甲雙胍、二甲雙胍和丙酮酸脫氫酶抑制劑二氯乙酸對(duì)胰腺癌的抑制作用。在個(gè)體化治療方面，有包括絲裂霉素C和順鉑、替西莫司(mTOR抑制)和salirasib與吉西他濱等多個(gè)治療有效并長(zhǎng)期生存的個(gè)例被報(bào)道[59,62]，隨著PDX應(yīng)用的更加廣泛，個(gè)體化治療的成效將更加明顯。

3．Hu-PDX：目前尚未有利用Hu-PDX研究胰腺癌免疫治療效果的報(bào)道，但其在其他實(shí)體瘤研究的經(jīng)驗(yàn)可以提供借鑒。將人外周血單個(gè)核細(xì)胞或成熟的免疫細(xì)胞亞群經(jīng)靜脈注入受照射的NOG或NSG小鼠體內(nèi)后，由循環(huán)中可檢測(cè)到人T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞，并被證明可以用于評(píng)價(jià)單克隆抗體、細(xì)胞因子治療(IL-2)、免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint blockade, ICB)和DC疫苗的作用[48,71-72]?？固妓狒窱X(carbonic anhydrase IX, CAIX)單克隆抗體與IL-2聯(lián)合應(yīng)用可通過誘導(dǎo)人NK和T細(xì)胞反應(yīng)抑制腎癌的進(jìn)展。在PBMC人源化小鼠模型中也觀察到nivolumab、阿替唑單抗、彭布羅單抗和烏魯單抗的抗腫瘤活性[73]。在PBMC人源化小鼠模型中比較DC疫苗制劑效果，并評(píng)估黑色素瘤相關(guān)抗原特異性免疫應(yīng)答和黑色素瘤抑制功能[74]。然而移植物抗宿主反應(yīng)(graft versus host reaction, GVHR)的發(fā)展和小鼠存活率低限制了這些模型在評(píng)估癌癥免疫治療有效性方面的應(yīng)用[75]。利用人CD34+造血干細(xì)胞建立人免疫系統(tǒng)可以克服GVHR的障礙。在小鼠主要組織相容性復(fù)合體匹配的情況下，干細(xì)胞能夠適應(yīng)小鼠的環(huán)境，發(fā)育成一個(gè)比較完整的人免疫系統(tǒng)。在胎肝造血干細(xì)胞生成的人源化小鼠的循環(huán)中檢測(cè)到人輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和DCs[76]。進(jìn)而在肝細(xì)胞癌PDX培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量和比例下降，而從腫瘤中分離出來的TIL顯示出受腫瘤改造的表型，包括免疫檢查點(diǎn)表達(dá)增加，細(xì)胞因子和細(xì)胞毒蛋白產(chǎn)生受損；同時(shí)在這個(gè)模型還觀察到了免疫檢查點(diǎn)抑制劑的不良反應(yīng)，這與臨床研究一致[76]。此外，在臍血造血干細(xì)胞生成的人源化小鼠模型中，nivolumab通過增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)、增加腫瘤中GrB+或IFN-γ+CD8+細(xì)胞和降低體內(nèi)HLA-DRlow髓樣細(xì)胞的比率來抑制MDA-MB-231細(xì)胞和CRC172細(xì)胞的生長(zhǎng)[77]。與單用nivolumab相比，組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)抑制劑OKI-179和nivolumab聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)，表明HDAC抑制劑可以改善體內(nèi)的抗腫瘤免疫應(yīng)答[77]。迄今為止，越來越多的研究表明在抗PD-1和抗CTLA-4治療后，人源化小鼠體內(nèi)的人PDX腫瘤發(fā)生了退行性改變[71]，表明人源化免疫腫瘤模型可以作為腫瘤免疫治療或聯(lián)合免疫治療研究的新興平臺(tái)。

四、展望

研究模型的進(jìn)步是推動(dòng)腫瘤學(xué)發(fā)展的重要?jiǎng)恿Α?D細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的成熟使腫瘤的基礎(chǔ)細(xì)胞分子研究成為可能，多種“基石”類的化療藥物得以發(fā)明。PDX模型的出現(xiàn)使研究腫瘤和機(jī)體間相互作用成為可能，為多種需要在體內(nèi)代謝的抗腫瘤藥物評(píng)估提供了幫助。而新一代類器官和人源化PDX模型的出現(xiàn)，使研究者可以在高度保留組織學(xué)特性、遺傳學(xué)特征和異質(zhì)性的同時(shí)，在體外重建腫瘤微環(huán)境信息，包括成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和免疫細(xì)胞，而這些特性的缺失正是既往胰腺腫瘤研究模型效率低下的重要原因。雖然這些模型還有需要完善的技術(shù)細(xì)節(jié)，在胰腺癌中的應(yīng)用還需進(jìn)一步探索，但相信隨著越來越多研究者的應(yīng)用，胰腺癌的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究必將迎來突破。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突