同種異體骨髓間充質干細胞對急性壞死性胰腺炎大鼠腹腔巨噬細胞極化的影響

王琳 徐萍 王靜 田軍 謝曉嵐

1南京醫(yī)科大學上海松江臨床醫(yī)學院，上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200090；2復旦大學附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200540

AP是臨床常見急腹癥，其發(fā)病急，進展快，若不及時治療則可能發(fā)展為SAP，甚至并發(fā)全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征[1-2]，最終導致患者死亡。以巨噬細胞為主的多種免疫細胞參與胰腺炎炎癥的起始、發(fā)展等各個階段。巨噬細胞在疾病發(fā)展的不同階段因所處微環(huán)境的不同而發(fā)生表型的變化并表現(xiàn)出不同的功能，這一過程稱為巨噬細胞極化。胰腺炎時，單核巨噬系統(tǒng)被激活，大量巨噬細胞發(fā)生M1型極化，釋放大量促炎細胞因子促進胰腺炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展[3]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，其免疫調(diào)節(jié)和組織修復功能在多種疾病中發(fā)揮治療作用[4-5]。體外實驗表明，BMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用與巨噬細胞極化有關。本研究通過尾靜脈注射BMSCs，觀察BMSCs對ANP大鼠炎癥反應的影響，探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

Sprague Dawley雄性大鼠30只，SPF級，鼠齡2.0～2.5個月，體重220～250 g，購于上海捷思杰實驗動物有限公司，動物合格證號為SCKK(滬)2013-0006。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組，ANP組，低、中、高劑量BMSCs治療組，每組6只。

制模前15 min經(jīng)腹腔注射0.8%戊巴比妥鈉進行麻醉，采用胰膽管逆行注入5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg的方法制備ANP模型。低、中、高劑量BMSCs治療組在制模后1 h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射0.5×106、1×106、3×106個BMSCs，BMSCs購于中國科學院細胞庫。對照組僅經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。ANP組在制膜后1 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。制模后12 h，先抽取腹水，計量，然后以20 ml預冷PBS行腹腔灌洗，收集灌洗液，并重復灌洗收集1次；抽取大鼠外周靜脈血；分離胰腺組織。

二、方法

1．血清生物化學指標檢測：外周靜脈血離心，收集上層血清，-80℃保存。采用胰淀粉酶檢測試紙(干化學法)檢測血清淀粉酶水平。采用ELISA法分別檢測血清TNF-α、IL-1β、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平。TNF-α、IL-1β試劑盒購自美國BioScience公司，MPO試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，按試劑盒說明書操作。

2．胰腺組織病理學檢查及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、精氨酸酶1(anginase1,Arg1)蛋白檢測：胰腺組織經(jīng)4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色。采用免疫組織化學染色檢測胰腺iNOS、Arg1蛋白的表達。iNOS抗體、Arg1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。由病理科醫(yī)師盲法閱片，每張切片隨機選擇8～10個高倍視野，采用Schmidt法從水腫、腺泡和脂肪壞死、出血、炎癥細胞浸潤4個方面進行病理評分[6]。以細胞質內(nèi)出現(xiàn)棕黃色微細顆粒為陽性巨噬細胞。

3．腹腔巨噬細胞收集及TNF-α、iNOS mRNA表達檢測：收集并記錄2次灌洗的腹腔灌洗液，以密度離心法4℃、2 000 g離心15 min，棄上清。離心后若有大量紅細胞，則加入于紅細胞2～3倍容積的紅細胞裂解液(上海碧云天生物有限公司)吹打，靜置2 min后再次離心棄上清，以DMEM完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素)重懸細胞，均勻接種于12孔板或10 cm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)4 h。待巨噬細胞貼壁后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收集巨噬細胞。應用Trizol抽提巨噬細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度。按照反轉錄試劑盒步驟將RNA逆轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR法檢測腹腔巨噬細胞TNF-α、iNOS mRNA表達量。Trizol、反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。TNF-α正向引物序列5′-GCATGATCCGAGATGTGGAACTGG-3′，反向引物序列5′-CGCCACGAGCAGGAATGAGAAG-3′；iNOS正向引物序列5′-GAGACGCACAGGCAGAGGTTG-3′，反向引物序列5′-CAGGAAGGCAGCAGGCACAC-3′；以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參。所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，△Ct值=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct值=△Ct實驗組-△Ct對照組，以公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。

4．腹腔M1(F4/80+CCR2+)型、M2(F4/80+CD163+)型巨噬細胞亞群表型檢測：收集上述10 cm培養(yǎng)皿中巨噬細胞，離心，PBS重懸后再次離心，按照F4/80-FITC、CCR2-PE、CD163-APC抗體說明書加入適量抗體(均購自北京博奧森生物工程有限公司)，室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸細胞，上流式細胞儀檢測巨噬細胞表面標志物。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、各組大鼠腹水量、血淀粉酶水平和胰腺組織病理變化

制模后12 h，ANP組大鼠腹水量、血淀粉酶水平均顯著高于對照組，各治療組大鼠腹水量均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。各治療組大鼠血淀粉酶水平與ANP組差異無統(tǒng)計學意義，各治療組之間腹水量和血淀粉酶水平差異也無統(tǒng)計學意義(表1)。

對照組大鼠胰腺組織結構清晰，腺泡細胞排列整齊，腺泡小葉結構完整。ANP組大鼠胰腺組織可見明顯腺泡細胞變性、壞死，小葉結構大部分破壞，小葉間隔增大，間隙水腫，紅細胞和炎細胞大量浸潤，病理評分顯著高于對照組。各治療組大鼠胰腺組織損傷明顯減輕，表現(xiàn)為小葉結構破壞減輕，變性、壞死減輕，炎細胞及紅細胞浸潤減少(圖1)，病理評分均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計學意義。各治療組間胰腺病理評分的差異有統(tǒng)計學意義，其中中劑量治療組胰腺病理評分顯著低于低、高劑量治療組(表1)。

免疫組織化學染色見ANP組大鼠胰腺組織內(nèi)有較多iNOS、Arg1陽性巨噬細胞，對照組及各治療組無陽性細胞或有少量陽性巨噬細胞(圖2)。

二、各組大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MPO水平

制模后12 h，ANP組大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MPO水平均顯著高于對照組，各治療組血TNF-α、IL-1β、MPO水平均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。各治療組間血TNF-α、IL-1β、MPO水平差異有統(tǒng)計學意義，其中中劑量治療組血TNF-α、IL-1β、MPO水平顯著低于低、高劑量治療組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表2)。

組別 只數(shù)腹水量(ml)血淀粉酶(U/L)胰腺病理評分對照組 60.83±0.52865.00±167.190ANP組 66.67±2.34a12820.00±4973.10a14.00±1.55a低劑量治療組64.17±0.98ab9886.67±2466.53a 6.50±1.04abc中劑量治療組64.17±1.17ab12643.33±5981.88a4.67±0.82ab高劑量治療組64.33±1.21ab11133.33±2815.18a 8.83±0.75abc

注：ANP為急性壞死性胰腺炎。與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01；與中劑量治療組比較，cP<0.05

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖1對照組(1A)、ANP組(1B)、高劑量治療組(1C)、中劑量治療組(1D)、低劑量治療組(1E)胰腺病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

圖2 對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠胰腺組織iNOS陽性(2A、2B、2C)及Arg1陽性巨噬細胞(2D、2E、2F)(免疫組織化學染色 ×400)

表2 5組大鼠血TNF-α、IL-1β和MPO水平

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α；IL-1β為白介素1β；MPO為髓過氧化物酶；ANP為急性壞死性胰腺炎。與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01；與中劑量治療組比較，cP<0.05

三、各組大鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、iNOS mRNA表達

制模后12 h，對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠腹腔巨噬細胞TNF-α mRNA表達量分別為1、6.53±3.45、2.16±0.98；iNOS mRNA表達量分別為1、7.37±2.98、2.32±1.88，ANP組顯著高于對照組，中劑量治療組顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

四、各組大鼠腹腔M1型、M2型巨噬細胞亞群比值比較

對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠F4/80+CCR2+M1型巨噬細胞與F4/80+CD163+M2型巨噬細胞比值分別為1.12±0.03、2.02±0.31、1.53±0.10，ANP組顯著高于對照組，中劑量治療組顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，圖3)。

討 論

巨噬細胞作為重要的先天和后天免疫細胞，其不同表型之間相互協(xié)調(diào)與穩(wěn)定是機體維持穩(wěn)態(tài)的必要條件，任何亞型的失衡都可能導致疾病的發(fā)生與發(fā)展[7]。巨噬細胞根據(jù)所處微環(huán)境的不同可極化為促炎M1型和免疫調(diào)節(jié)的抑炎M2型。腹腔巨噬細胞的激活是SAP發(fā)生的早期事件，本課題組前期研究結果表明，腹腔巨噬細胞活化參與胰腺炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展[8]，因此，通過早期調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化表型，可有效避免M1型巨噬細胞的過度激活，從而減輕胰腺炎癥狀。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎圖3 對照組(3A、3B)、ANP組(3C、3D)、中劑量治療組(3E、3F)大鼠腹腔M1型和M2型巨噬細胞流式細胞分析圖

BMSCs是一種具有組織修復能力的多能干細胞，除在神經(jīng)學、骨學等學科發(fā)揮組織修復功能外[9-10]，還可遷移至炎癥部位，并通過改變免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)炎癥反應，在寄生蟲感染、敗血癥等疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。研究表明干細胞可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化表型影響疾病的炎癥反應過程[14-15]。體外BMSCs與巨噬細胞共培養(yǎng)結果顯示，BMSCs可誘導巨噬細胞M1型向M2型分化，發(fā)揮免疫抑制作用[16]。Zhang等[17]證明人牙齦間充質干細胞可誘導巨噬細胞M2型極化，促進傷口愈合。

本研究結果顯示，制模后12 h，ANP組大鼠胰腺組織明顯壞死，小葉結構明顯破壞，細胞間隙水腫，紅細胞和炎癥細胞大量浸潤。經(jīng)BMSCs治療后，大鼠胰腺組織損傷明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少；TNF-α、IL-1β、MPO血清水平及腹腔巨噬細胞TNF-α、iNOS mRNA表達顯著下調(diào)，表明BMSCs通過抑制炎癥因子表達，減輕ANP大鼠胰腺組織損傷，發(fā)揮一定的治療作用。本研究結果還顯示，ANP組大鼠M1型與M2型巨噬細胞比值顯著高于對照組，BMSCs治療組顯著低于ANP組，表明ANP發(fā)生后，巨噬細胞以M1型為主，BMSCs治療后M1型細胞顯著減少，提示BMSCs可能通過抑制ANP大鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化來減輕胰腺組織損傷及全身炎癥反應。BMSCs是促使ANP大鼠腹腔巨噬細胞M2型極化還是促進M1型轉化為M2型，尚需要加大樣本量和延長治療時間進一步驗證。

然而不同劑量BMSCs發(fā)揮的作用并不相同。本研究應用3種劑量(0.5×106、1×106、2×106個細胞)治療ANP大鼠，結果顯示，中劑量治療組的治療效果最佳，推測可能與高劑量細胞引起微循環(huán)細胞團塊栓塞有關[18]。因此，尋找最佳干細胞注射劑量可能是發(fā)揮干細胞最大治療作用的關鍵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突