非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織Vaspin表達(dá)及其意義探討*

姜佳麗，李 莉，趙 菲，鐘樂萍，郭子皓，張 川，展玉濤

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精及其他損肝因素所致的以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，主要包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎以及相關(guān)的肝硬化和肝癌[1-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球NAFLD平均患病率為25.4%，我國NAFLD患病率也高達(dá)20.1%[5-8]。單純性脂肪肝為良性病變，進(jìn)展緩慢，但大約20%脂肪性肝炎在10年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化，甚至部分NAFLD患者可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。NAFLD已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生問題。因此，加強(qiáng)NAFLD的防治研究非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，NFALD發(fā)病與肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)，但確切發(fā)病機(jī)制仍不明確[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種脂肪因子在NAFLD發(fā)病過程中起重要作用[2-5]。內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor，Vaspin)是新近從肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織分離的一種脂肪因子，是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，主要表達(dá)于內(nèi)臟和皮下脂肪組織，但其在NAFLD個(gè)體肝組織的表達(dá)狀況尚不清楚[6,7]。本研究采用免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)了NAFLD大鼠肝組織和體外培養(yǎng)的脂肪變性肝細(xì)胞Vaspin蛋白表達(dá)情況，以期發(fā)現(xiàn)Vaspin在NAFLD發(fā)病中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞與試劑 12只SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)健康雄性大鼠，3月齡，體質(zhì)量150～180 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【許可證號(hào)：XCXK-(軍)2007-0040】，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水，每日明暗時(shí)間均為12 h，室溫23～26℃，濕度為50%左右，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，通風(fēng)良好。HepG2細(xì)胞購自深圳市百恩微生物科技有限公司，高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司，抗Vaspin抗體購自上海莼試生物技術(shù)有限公司(批號(hào)CS4593)。

1.2 脂肪肝模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將12只SD大鼠分為模型組6只和對(duì)照組6只。給予模型組動(dòng)物高脂飲食(Lieber-DeCarli 液體高脂飲食，能量分配：70%脂肪，11%碳水化合物，18%蛋白質(zhì))，飼養(yǎng)7 w；在對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食(能量分配：35%脂肪，47%碳水化合物，18%蛋白質(zhì))飼養(yǎng)7 w。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取肝組織，用10%甲醛緩沖液固定，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。采用常規(guī)免疫組織化學(xué)法，抗體濃度為1:50，以正常肝組織作為陰性對(duì)照，以脂肪組織作為陽性對(duì)照，染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜染色呈棕黃色為陽性。

1.3 脂肪變性肝細(xì)胞模型的建立 取HepG2細(xì)胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，消化傳代，24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分為正常組和脂肪變性組。在正常組，按上述方法培養(yǎng)換液，在脂肪變性組，在換液時(shí)換成終濃度為100 μM油酸(OA)的完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)72 h，收集細(xì)胞。

1.4 脂肪變性細(xì)胞Vaspin表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液和等量的2×Sample buffer，混和，100℃沸水煮10 min，行SDS-PAGE電泳。切下含目的條帶的SDS變性膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。隨后，在含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉60 min。加一抗(1:200) ，4℃孵育過夜，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。然后，與耦聯(lián)HRP的二抗(1:1000)室溫孵育1 h，最后用TBST洗膜3次后，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室內(nèi)進(jìn)行X光片曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)改變 對(duì)照組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)正常，無細(xì)胞變性壞死，肝細(xì)胞索排列規(guī)整；模型組大鼠肝組織肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多的脂滴(圖1)。

圖1 兩組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn) (HE，400×)

2.2 兩組肝組織Vaspin表達(dá)情況比較 在模型組，可見肝細(xì)胞脂滴表面Vaspin表達(dá)增強(qiáng)，主要表達(dá)于脂滴周圍，呈深棕色，而對(duì)照組則呈陰性(圖2)。

圖2 肝組織Vaspin表達(dá)情況 (Sp，400×)

2.3 兩組HepG2細(xì)胞Vaspin蛋白表達(dá)情況 在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，結(jié)果顯示脂肪變性肝細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞Vaspin/GAPDH表達(dá)分別為(0.49±0.70)和(0.68±0.40)，差異具有顯著性 (P<0.05，圖3)。

圖3 兩組細(xì)胞Vaspin表達(dá)情況

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高以及肥胖和糖尿病人口的不斷增加，NAFLD的發(fā)病率逐年升高，NAFLD已成為當(dāng)今世界最常見的慢性肝病[9]。盡管NAFLD的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，占主導(dǎo)地位的是二次打擊學(xué)說，即第一次打擊為代謝異常引起的胰島素抵抗，脂質(zhì)代謝異常引起脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)過多聚集，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。第二次打擊為在第一次打擊的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、脂肪因子和炎癥因子分泌，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。第二次打擊可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和凋亡，引起肝臟炎癥的發(fā)生，形成脂肪性肝炎。肝臟炎癥進(jìn)一步激活肝臟星狀細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成肝纖維化和肝硬化[10-12]。在此學(xué)說中，脂肪因子在脂肪性肝炎發(fā)生過程中起重要作用。已經(jīng)證實(shí)，脂肪組織是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，能分泌多種具有生物活性的脂肪因子，包括瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素和Vaspin等，其異常表達(dá)與胰島素抵抗或糖脂代謝有關(guān)，它們可通過多種途徑使脂肪組織釋放更多的游離脂肪酸，增多的游離脂肪酸被肝臟攝取，導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[14]。

Vaspin是由Hida et al近年從OLETF大鼠(一種2型糖尿病模型動(dòng)物，具有腹型肥胖、胰島素抵抗、高血壓、高血脂等特征)的內(nèi)臟脂肪組織中分離得到的一種脂肪因子，具有典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑的特點(diǎn)，其異常表達(dá)與胰島素抵抗有關(guān)[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin能夠增加肥胖小鼠腹部?jī)?nèi)網(wǎng)膜白色脂肪組織和皮下白色脂肪組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4和脂聯(lián)素的表達(dá)，抑制瘦素、抵抗素和TNF-α的表達(dá)，推測(cè)Vaspin可能通過參與調(diào)控胰島素抵抗相關(guān)基因表達(dá)，而胰島素抵抗是NAFLD發(fā)病的重要因素，因此我們推測(cè)Vaspin可能與NAFLD的發(fā)病有關(guān)。關(guān)于Vaspin與脂肪肝的關(guān)系，目前存在爭(zhēng)議，多數(shù)研究表明血清Vaspin水平增加可能與NAFLD發(fā)生有關(guān)[3，16]，但也有少數(shù)研究認(rèn)為血清Vaspin與NAFLD發(fā)生無關(guān)[17]。血清Vaspin水平受多種因素的影響，不能完全反映Vaspin在NAFLD動(dòng)物肝組織尤其是肝組織脂肪變性細(xì)胞中的表達(dá)情況，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于Vaspin在脂肪肝組織中的表達(dá)研究。故本研究采用免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)了NAFLD大鼠肝組織和體外培養(yǎng)的脂肪變性肝細(xì)胞Vaspin蛋白表達(dá)情況，以期發(fā)現(xiàn)Vaspin在NAFLD發(fā)病過程中的作用。

本研究采用Lieber-DeCarli液體高脂飲食飼養(yǎng)SD大鼠，成功制備NAFLD模型。NAFLD 模型的制備方法有多種，其中Lieber et al應(yīng)用高脂飲食和自由取食方法建立的NAFLD 模型與臨床上NAFLD 患者的情況有相似之處，而且這種方法可以復(fù)制非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大部分肝臟病理學(xué)特征。Lieber-DeCarli 液體高脂飲食中多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量均較高，分別為 42%和 41%。另外，這種高脂飲食的成分都是較易購買到的，并且模型制備的時(shí)間也相對(duì)較短。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了Lieber-DeCarli 液體高脂飲食方法制備NAFLD 模型。我們應(yīng)用 Lieber-DeCarli 液體高脂飲食飼養(yǎng) SD 大鼠 7 周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝臟出現(xiàn)了NAFLD 的病理學(xué)變化，大部分肝細(xì)胞出現(xiàn)了脂肪變性，肝組織有氣球樣變的肝細(xì)胞。因此，我們的研究結(jié)果也證實(shí)，應(yīng)用Lieber-DeCarli 液體高脂飲食飼養(yǎng)SD 大鼠能成功制備NAFLD 動(dòng)物模型。

本研究中我們采用免疫組化方法檢測(cè)肝組織Vaspin表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠脂肪肝組織Vaspin表達(dá)增強(qiáng)。人原代培養(yǎng)肝細(xì)胞是人類肝臟細(xì)胞的適宜模型，人類肝細(xì)胞來源的細(xì)胞系HepG2具有類似人原代肝細(xì)胞的特征，并且易于獲得和培養(yǎng)。我們?cè)贖epG2細(xì)胞，通過體外實(shí)驗(yàn)直接研究脂肪變性的HepG2細(xì)胞Vaspin表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的脂肪肝細(xì)胞Vaspin表達(dá)增強(qiáng)，從而支持Vaspin可能與NAFLD發(fā)生有關(guān)。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，我們還發(fā)現(xiàn)Vaspin主要分布于肝細(xì)胞脂滴周圍。脂滴是一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由甘油三酯和膽固醇構(gòu)成脂滴核心，外面附著單層磷脂分子，磷脂單層內(nèi)鑲嵌多種蛋白，即脂滴相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)脂滴相關(guān)蛋白種類繁多，有上百種，一般分為三類，即脂滴結(jié)構(gòu)功能蛋白、脂代謝相關(guān)蛋白酶和脂滴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。脂滴相關(guān)蛋白對(duì)脂滴的形成、代謝及其調(diào)控起重要作用[18-20]，其中PAT家族蛋白是現(xiàn)在研究最多的蛋白。PAT家族蛋白以脂滴表面為平臺(tái)對(duì)脂滴內(nèi)脂質(zhì)代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。脂肪分化蛋白是PAT家族的一員，主要表達(dá)于脂肪組織、胰腺、小腸粘膜等。研究發(fā)現(xiàn)脂肪分化蛋白可促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯以脂滴形式儲(chǔ)存于胞漿，高脂飲食誘發(fā)的脂肪肝小鼠脂肪分化蛋白水平明顯升高，而基因敲除小鼠甘油三酯含量明顯降低，具有抗脂肪肝的作用[20]。在本研究，我們發(fā)現(xiàn)Vaspin表達(dá)于脂滴周圍，推測(cè)Vaspin可能是一種脂滴相關(guān)蛋白，它對(duì)脂滴形成及代謝可能有一定的影響。NAFLD以肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成為主要特征。因此，我們推測(cè)Vaspin可能通過影響脂滴形成，從而參與NAFLD的發(fā)病，但其詳細(xì)作用及其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探明。