神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠/BMP-2/脫鈣骨復(fù)合材料的制備及性能*

劉 艷，朱繼翔，陳 煒，朱郇憫, 陳曉明

(廣州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系，廣州 511436)

0 引 言

骨缺損病例在臨床治療中十分常見，常造成骨不連接，延遲愈合或不愈合及局部的功能障礙，影響人們生活質(zhì)量甚至威脅生命。目前，臨床上通常采用的骨修復(fù)材料仍存在成骨活性不高的問題,難以滿足臨床需求[1]。脫鈣骨基質(zhì)(demineratized bone matrix，DBM)是一種天然骨衍生材料，自20世紀60年代人們就對其做了大量研究，DBM含有促進骨等硬組織形成所必須的生物活性物質(zhì),具有優(yōu)異的性能[2]。早在 1965年 Urist用同種脫鈣骨基質(zhì)誘發(fā)肌肉內(nèi)異位成骨,證實了骨誘導(dǎo)學說,首次提出 DBM 具有誘導(dǎo)成骨的能力[3]。DBM具有傳導(dǎo)和誘導(dǎo)骨形成的雙重作用，是一種理想的骨組織工程支架材料,大量研究證明DBM種植體可應(yīng)用于骨缺損修復(fù)。然而DBM的臨床應(yīng)用尚存在一些不足，骨誘導(dǎo)因子在制備過程中通常會被消除或降低，不具備足夠的骨誘導(dǎo)活性；另一方面，DBM中的生長因子釋放可能是不連續(xù)的, 可能會影響它的骨誘導(dǎo)活性。

研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)可以提高DBM的骨誘導(dǎo)活性[4]。BMP-2能單獨誘導(dǎo)異位成骨和單獨促進骨缺損修復(fù)，骨組織工程常將生物活性大分子與支架結(jié)合來增加材料的骨誘導(dǎo)活性[5]。如果將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、BMP-2等復(fù)合到DBM中,可以得到更好的成骨效果[6]。

脫細胞組織的細胞外基質(zhì)(ECM)作為支架在組織工程有廣泛的應(yīng)用，并且越來越普遍，其制備形式多，包括片，粉末和水凝膠[7]。制備ECM的組織來源廣泛，如真皮、膀胱、心肌、腦、心包、小腸粘膜下層、脊髓、脂肪等[7-12]。完整的ECM支架材料具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，保留了天然組織中發(fā)現(xiàn)的大量生物活性成分，如層粘連蛋白、細胞粘附蛋白，生長因子和糖胺聚糖等。由天然的生物組織制備的凝膠比通過合成制備的凝膠具有更好生物相容性和更高的生物活性。脫細胞基質(zhì)凝膠的成分和結(jié)構(gòu)符合仿生學的要求，具有強大的潛力[13]。

本研究旨在制備出具有緩釋生長因子功能的DBM復(fù)合神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠的復(fù)合材料，并考察其能否滿足構(gòu)建結(jié)構(gòu)性組織工程骨組織的需要。

1 實 驗

1.1 實驗材料及試劑

豬干骨、豬脊髓、Triton-100(MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY COMPANY)、脫氧膽酸鈉(BIOSHARP)、雙氧水(SCR，分析純)、鹽酸、京尼平(WaKo 和光)、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2 Novoprotein)

1.2 神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠/BMP-2/脫鈣骨復(fù)合材料的制備

取新鮮豬干骨,處理干凈，在30%過氧化氫條件下處理48 h；室溫下用蒸餾水反復(fù)浸洗30 min；用改良脫鈣液浸泡72 h，每24 h換液；蒸餾水反復(fù)浸洗30 min,真空冷凍干燥機干燥24 h，將脫鈣骨(DBM)切成1 cm×1 cm×0.5 cm。

取新鮮豬脊髓，剪去表面脂肪組織和部分神經(jīng)外膜，置于蒸餾水漂洗6 h；3% Trition-X100震蕩12 h；蒸餾水漂洗3次；4% 脫氧膽酸鈉水溶液震蕩24 h；蒸餾水漂洗3次。上述步驟再循環(huán)一次制得脫細胞神經(jīng)組織。神經(jīng)脫細胞組織經(jīng)冷凍干燥后粉碎，加入胃蛋白酶、0.01 mol/L HCL制得脫細胞神經(jīng)預(yù)凝膠,加入0.1 mol/L NaOH、10×PBS,獲得脫細胞神經(jīng)凝膠溶液；加入BMP-2;分別加入1%京尼平、2%京尼平、3%京尼平，室溫下放置數(shù)分鐘后形成凝膠。

將神經(jīng)脫細胞(NAM)凝膠在真空抽濾裝置下灌注到制備好的脫鈣骨中，加入40 μL脫細胞神經(jīng)凝膠充滿脫鈣骨孔隙，每40 μL脫細胞神經(jīng)凝膠含有0.8 μg BMP-2。冷凍真空冷凍干燥神經(jīng)脫細胞凝膠/京尼平/脫鈣骨。根據(jù)加入的京尼平含量不同，將其分組為NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3。

1.3 復(fù)合材料性能

1.3.1 復(fù)合材料掃描電子顯微鏡觀察

取β-TCP、DBM、NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3支架，用真空冷凍干燥器干燥后，表面噴金后掃描電鏡觀察。

1.3.2 材料力學性能測試

制備尺寸為8 mm×15 mm×5 mm DBM和β-TCP和NAM/DBM三組樣品，使用萬能拉力壓縮測試儀進行單軸壓縮試驗，壓縮速率為20 mm/min。

1.3.3 BMP-2體外釋放研究

將NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3分別浸泡在裝有500 μL PBS的1 mL試管中，放置于37 ℃、80 r/min恒定轉(zhuǎn)速的恒溫培養(yǎng)箱中。在設(shè)定取樣時間點內(nèi)取樣，每次將500 μL液體取完，重新加入500 μL PBS。根據(jù)ELISA試劑盒測定3組支架中BMP-2的釋放量，通過式(1)計算得BMP-2累積釋放率,n=4。

累積釋放率=(Ct1V+…+CtnV)/0.8×100

(1)

其中，Ctn為n時間點取樣時BMP-2濃度

1.3.4 細胞-支架共培養(yǎng)

將β-TCP、DBM、NAM/DBM制備成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，用75%乙醇浸泡30 min，紫外照射30 min消毒，PBS清洗3次后置于6孔板中。將MC3T3-E1細胞分別種植到3種支架上，每孔細胞數(shù)量為1×105個細胞。用含有10%FBS,1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(Gibco)在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩天換一次液。培養(yǎng)1天后用多聚甲醛固定后，掃描電鏡觀察細胞在支架上形態(tài)；細胞-支架共培養(yǎng)1、3、5、7d后用CCK-8試劑盒檢測MC3T3-E1細胞在支架上增值情況并用Dead/Live試劑盒進行染色，正置熒光顯微鏡觀察；細胞-支架共培養(yǎng)3、7、14 d后，用ALP試劑盒、BCA試劑盒檢測其堿性磷酸酶活性。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗中所有統(tǒng)計分析均使用SPSS進行。結(jié)果表示為平均值±標準偏差。單因素方差分析用于檢驗統(tǒng)計學顯著性，P<0.05被認為是指示統(tǒng)計學顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫鈣骨復(fù)合脫細胞神經(jīng)基質(zhì)凝膠支架表面結(jié)構(gòu)及力學性能

骨支架作為種子細胞和生長因子的載體，是骨組織修復(fù)的關(guān)鍵。骨支架的微觀結(jié)構(gòu)和材料性能對骨修復(fù)和再生有重要影響。由圖1(a)、(c)可知，DBM為三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑為152～529 μm,孔洞相互貫通，具有天然的孔隙，簡單易得，大孔徑有利于營養(yǎng)物質(zhì)運輸和血管長入。圖1(b)、(d)為β-TCP表面形貌，β-TCP，孔徑為105～408 μm,其孔隙比DBM小，密度較高。

由于支架材料是多孔的，NAM凝膠可以整合在DBM基質(zhì),增大內(nèi)表面積[14]。NAM凝膠屬于生物來源凝膠，來源于生物組織的細胞外基質(zhì)，其成分和結(jié)構(gòu)符合仿生學要求，研究發(fā)現(xiàn)NAM凝膠是目前最接近細胞生長天然環(huán)境的支架材料[15]。NAM凝膠當未使用交聯(lián)劑時，只有少量NAM凝膠與DBM復(fù)合(圖2(b);交聯(lián)劑含量為1%時復(fù)合的NAM凝膠量比無交聯(lián)劑時多(圖2(c)；交聯(lián)劑含量為2%時復(fù)合的NAM凝膠量明顯增多(圖2(d)；交聯(lián)劑含量為3%時復(fù)合的NAM凝膠量最高(圖2(e)。由圖2可知DBM與NAM凝膠的復(fù)合程度與交聯(lián)劑含量呈正比，復(fù)合材料的交聯(lián)劑含量越高，DBM交聯(lián)NAM凝膠量越多。

支架的力學性能對骨組織修復(fù)具有重要的影響。適當?shù)牧W強度是理想的骨組織工程材料要求之一。由圖3(a)、(b)可知β-TCP組的抗壓強度顯著高于DBM、NAM/DBM,β-TCP組密度比其他兩組材料密度高。圖3(b)中β-TCP的抗壓強度為(20.5±1.26)MPa,DBM的抗壓強度為(1.04±0.44)MPa, NAM/DBM的抗壓強度為(1.00±0.30)MPa.脫鈣骨復(fù)合脫細胞基質(zhì)凝膠后，抗壓強度稍低于未復(fù)合脫細胞基質(zhì)凝膠，但兩組材料的抗壓強度沒有顯著性差異,結(jié)果表明復(fù)合凝膠對DBM的力學性能沒有影響。

圖2 DBM、NAM/DBM、NAM/Genipin/DBM 掃描電鏡圖

圖3 力學性能

2.2 體外BMP-2釋放動力學

NAM凝膠是一類可吸收保持大量水分但不溶于水的三維生物材料[13]。將BMP-2溶于蒸餾水，利用NAM凝膠可吸收保持大量水分但不溶于水的特性可使NAM凝膠負載一定量的BMP-2。Genipin是一種天然優(yōu)良的生物交聯(lián)劑，研究發(fā)現(xiàn)在水凝膠中添加一定量交聯(lián)劑可以減慢其降解速度。不同含量的Genipin與神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)和溶脹度可影響釋放行為[16]。在NAM凝膠中加入Genipin可以延長降解時間，增加BMP-2持續(xù)釋放時間。在早期研究基礎(chǔ)上，本文探討了Genipin的量對BMP-2釋放規(guī)律的影響。結(jié)果表明，交聯(lián)劑量為3%的復(fù)合支架組緩釋量最大，緩釋效果最佳。復(fù)合支架中BMP-2釋放情況如圖4所示。在釋放前13天，當Genipin用量為2%時,復(fù)合材料中BMP-2釋放率高于Genipin用量為1%、3%的復(fù)合材料中的BMP-2。釋放中后期，Genipin量為3%一組的復(fù)合支架釋放BMP-2量明顯高于含Genipin量為1%、2%的兩組復(fù)合支架，在34d內(nèi)釋放總量達到34%±4%，其累積釋放與釋放時間呈現(xiàn)線性增長，無暴釋現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 BMP-2累計釋放曲線圖

2.3 細胞在支架上生長

將MC3T3-E1細胞種植到復(fù)合支架上來考察負載BMP-2的復(fù)合支架對細胞生長的影響。MC3T3-E1細胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1d后，通過掃描電子顯微鏡觀察，可見細胞在NAM/DBM(圖5(a))、β-TCP(圖5(b))上呈圓形貼附于材料表面生長。在NAM/DBM材料表面，粘附的細胞數(shù)量多，部分細胞形態(tài)開始改變，并分泌出少量基質(zhì)，在β-TCP材料表面，粘附細胞數(shù)量較少，細胞大部分長出觸角。NAM凝膠具有良好的生物相容性和親水性，細胞易于粘附在其表面。另外，NAM凝膠支架具備多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于細胞向內(nèi)生長[15]。MC3T3-E1細胞培養(yǎng)第1、3、5、7 d用正置熒光顯微鏡觀察其在材料表面生長情況?；罴毎?綠色)填充于支架孔隙，未見死細胞(紅色)。培養(yǎng)時間延長，材料表面細胞逐漸增多，細胞生長狀態(tài)逐漸變好，總體呈現(xiàn)較好的增值趨勢。在第7天時，細胞在NAM/DBM(圖6d)、β-TCP(圖6(h))支架上大部分都鋪展開呈梭形，生長情況最佳。

圖5 細胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1d掃描電鏡觀察

MC3T3-E1細胞在不同材料上1、3、5、7 d天后用CCK-8試劑盒驗證細胞在支架材料上的情況。從圖7可以看出隨著培養(yǎng)時間的延長，各組的吸光度值都逐漸增高。在第3、5、7天負載BMP-2因子的支架材料細胞活性顯著高于DBM和β-TCP組。結(jié)合圖5證明負載BMP-2的脫細胞神經(jīng)凝膠對細胞的生長具有促進作用，NAM/BMP-2/DBM支架可以促進細胞增殖, NAM/BMP-2/DBM支架材料對細胞無毒性作用，是一種有效負載BMP-2的方法。

圖6 MC3T3-E1細胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1、3、5、7d 死/活細胞染色(正置熒光顯微鏡)

ALP活性表達是成骨細胞分化的一個特征，高ALP活性有利于成骨作用。用ALP試劑盒檢測MC3T3-E1細胞在不同材料上培養(yǎng)3、7、14d后ALP活性值。在第14天，負載BMP-2的支架和β-TCP上的細胞顯示出最大的ALP活性。在第7、14天，負載BMP-2的支架上細胞ALP活性顯著高于β-TCP，表明NAM/BMP-2/DBM 支架具有良好促成骨分化作用。

圖7 支架材料CCK-8活性

圖8 ALP活性

3 結(jié) 論

通過上述實驗研究，可得出以下結(jié)論：

(1)神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料具有良好的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑約152～529 μm ,互相連通，有利于骨組織長入；

(2)神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料可緩釋BMP-2，京尼平含量為3%時，可持續(xù)釋放至少34 d，累積釋放量為34%，期間無暴釋現(xiàn)象發(fā)生，表明以京尼平為交聯(lián)劑制備神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨可有效地復(fù)合BMP-2并且具有緩釋BMP-2的功能。

(3)神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料無細胞毒性，MC3T3-E1細胞在材料上生長狀況良好，隨著時間增長不斷增殖，表明神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料具有良好的生物相容性；

(4)神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料的ALP活性在第7、14天顯著高于β-TCP組，表明其具有較高的成骨活性。

(5)綜合神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料的微觀結(jié)構(gòu)、藥物緩釋作用、生物相容性和成骨分化活性各方面的評價，神經(jīng)脫細胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料有望成為一種理想的骨修復(fù)材料。