金蓮花湯抗流感病毒活性研究△

王騰宇，劉斯琪，丁鵬敏，劉雙月，王青青，龐月笙，胡秀華，王如峰

北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院，北京 102488

金蓮花湯是2003年國家中醫(yī)藥管理局公布的預防非典型肺炎的處方，由大青葉(Isatidis Folium)、葛根(Puerariae Radix)、蒲公英(Taraxaci Herba)、蘇葉(Perillae Folium)和金蓮花(Trollii Flos)按照一定比例組成，可用于風溫病的治療。中醫(yī)認為流行性感冒(簡稱流感，中醫(yī)稱“時行感冒”)是由風熱溫邪引起，為機體正氣虧虛，外感疫毒之邪(“癘氣”)夾時令之氣乘虛而入、中傷機體所致[1]，也屬于風溫病的范疇，故金蓮花湯也可用于流行性感冒的治療。西醫(yī)則認為流感是流感病毒引起的急性呼吸道感染[2]，是一種傳染性強、傳播速度快的疾病，對于流感的治療關鍵是抗流感病毒[3]。因此，金蓮花湯用于治療流感應該與其抗流感病毒活性有關。

中藥復方是在中醫(yī)理論指導下，按“辨證施治”的原則，根據(jù)“君臣佐使”關系由多味單味藥組成[4]。對于中藥組方的研究需要從多方面對其進行探索和研究，其中拆方是研究中藥復方組方原理的重要手段之一[5]。對金蓮花湯進行拆方研究，可以了解組成金蓮花湯的各單味藥對全方的抗病毒活性的貢獻度，從而證明組方的合理性。

1 材料

1.1 細胞系、病毒株

細胞系選擇狗腎細胞(MDCK)，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心(Cell Resource center，IBMS，CAMS/PUMC)，經本實驗室傳代后凍存?zhèn)溆?。病毒株為甲型流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)，由中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所提供，經本實驗室雞胚擴增、測定滴度后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及試藥

CO2培養(yǎng)箱[MCO-18AIC(UV)，Sanyo]，倒置熒光相差顯微鏡(TS2000-S，Nikon)，移液器(20/200/1000 μL，Corning)。

DMEM(Gibco)，胎牛血清(FBS)(Gibco)，胰酶(Hyclone)。研究用中藥購自河北安國藥材市場，經北京中醫(yī)藥大學王如峰教授鑒定為正品，大青葉為蓼科植物蓼藍PolygonumtinctoriumAit.的干燥葉，葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Wild.) Ohwi的干燥根，蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.干燥全草，蘇葉為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.的干燥葉，金蓮花為毛莨科植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。連花清瘟膠囊(批號：A1601075)為石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司產品，利巴韋林片(批號：20160601)為北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司產品，兩者均購自北京金象大藥房花家地店。

2 制備

2.1 試藥制備

稱取蒲公英37.5 g、金蓮花15 g、大青葉25 g、葛根25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入蘇葉15 g，繼續(xù)微沸煎煮15 min，收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集合并2次濾液，得到金蓮花湯全方試藥。

稱取蒲公英37.5 g、金蓮花15 g、大青葉25 g、葛根25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮30 min收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，得到缺蘇葉試藥[6]。

稱取蒲公英37.5 g、金蓮花15 g、大青葉25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入蘇葉15 g，繼續(xù)微沸煎煮15 min，收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，得到缺葛根試藥。

稱取蒲公英37.5 g、金蓮花15 g、葛根25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入蘇葉15 g，繼續(xù)微沸煎煮15 min，收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，得到缺大青葉試藥。

稱取蒲公英37.5 g、大青葉25 g、葛根25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入蘇葉15 g，繼續(xù)微沸煎煮15 min，收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，得到缺金蓮花試藥。

稱取金蓮花15 g、大青葉25 g、葛根25 g，加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入蘇葉15 g，繼續(xù)微沸煎煮15 min，收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，得到缺蒲公英試藥。

稱取蒲公英37.5 g、金蓮花15 g、大青葉25 g、葛根25 g、蘇葉15 g，分別加適量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min，微沸煎煮30 min收集濾液，再次加入適量蒸餾水浸沒藥材，大火煎煮30 min，收集并合并2次濾液，分別得到蒲公英、金蓮花、大青葉、葛根、蘇葉試藥。

將上述試藥濃縮至0.5 g·mL-1，冷凍干燥，4 ℃冷藏備用。

2.2 溶液制備

2.2.1磷酸緩沖溶液(PBS)制備 精密稱取0.20 g KCl、8.00 g NaCl、0.20 g KH2PO4、3.90 g Na2HPO4·12H2O，溶解于1 L超純水中，用4% NaOH調節(jié)pH至7.2～7.4，分裝，高溫高壓滅菌，室溫冷卻，標記，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2胰酶制備 精密稱取胰酶粉末0.10 g溶解于200 mL PBS中，加入酚紅指示劑，調節(jié)pH至8.0左右，再加入乙二胺四乙酸(EDTA)0.04 g，磁力攪拌器攪拌至完全溶解，0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3MTT溶液制備 精密稱取MTT粉末0.25 g，溶解于50 mL PBS中，注意避光，超聲溶解。溶解完全后以0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4培養(yǎng)基制備 不完全DMEM培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基粉末1袋(1 L規(guī)格)，加入1 L超純水，磁力攪拌器攪拌使其完全溶解，再加入1.98 g NaHCO3，調節(jié)pH至7.2～7.4，0.22 μm無菌過濾器過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞生長液(完全DMEM培養(yǎng)基)：不完全DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸、1%青鏈霉素，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞維持液：不完全培養(yǎng)基中加入2%胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸、1%青鏈霉素，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病毒生長液：不完全DMEM培養(yǎng)基中加入胰酶，最終胰酶質量濃度為6.6 μg·mL-1。

細胞凍存液(現(xiàn)用現(xiàn)配)：不完全DMEM培養(yǎng)基中加入20% FBS和8% DMSO，混勻。

2.2.5供試品溶液制備 分別稱取上述試藥和連花清瘟膠囊粉末各4.0 mg，加入細胞維持液4 mL，配制質量濃度為1 mg·mL-1的試藥，溶解充分，0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，對半稀釋得到不同稀釋度的試藥，質量濃度分別為：1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.80、3.90、1.95 μg·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 方法

3.1 病毒毒力檢測

將處于對數(shù)期的MDCK細胞按照1.0×105個/mL接種到96孔板上，每孔100 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h至細胞長成單層。棄去96孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次。用病毒生長液將病毒按照10倍倍比稀釋為不同濃度，分別加入上述長成單層細胞的96孔板中，每孔100 μL(n=8)。設置正常對照組，放入37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中吸附2 h后，棄去病毒液，加入病毒生長液100 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞病變情況，直到細胞不再出現(xiàn)新的病變。顯微鏡下觀察并記錄每個稀釋倍比下出現(xiàn)細胞病變的孔數(shù)，記錄細胞病變效應(CPE)。按照Reed & Muench法計算病毒半數(shù)致死量(TCID50)[7]。

3.2 供試品細胞毒性檢測

將對數(shù)期的MDCK細胞按照1.0×105個/mL接種到96孔板上，每孔100 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h至細胞在96孔板底部長成單層。棄去細胞培養(yǎng)基，將對半稀釋后不同濃度的試藥分別加入上述長成單層細胞的96孔板中，并設置空白對照組(n=8)。培養(yǎng)72 h，棄去含藥培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使96孔板底部結晶充分溶解。用酶標儀檢測每孔的吸光度(A)值，檢測波長為490 nm。根據(jù)測得的A值，按照公式(1)計算細胞存活率，利用SAS 9.30進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析[8]。

細胞存活率=A實驗/A細胞對照×100%

(1)

3.3 體外抗病毒實驗

將對數(shù)期的MDCK細胞按照1.0×105個/mL接種到96孔板上，每孔100 μL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h至細胞在96孔板底部長成單層。棄去細胞培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次。將劑量為100 TCID50的病毒接種于已長成單層的MDCK細胞的96孔培養(yǎng)板上，在培養(yǎng)箱內吸附2 h。棄去病毒液，加入按照各個試藥共同無毒濃度稀釋得到的試藥，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。設置陽性藥組(利巴韋林、連花清瘟膠囊)，正常細胞對照組(陰性對照)、病毒對照組(空白對照)，每組8個平行孔。連續(xù)觀察3 d，觀察CPE。棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混勻。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使96孔板底部結晶充分溶解。用酶標儀檢測每孔的吸光度(A)值，檢測波長為490 nm。根據(jù)測得的A值，按照公式(2)計算藥物抗病毒有效率(ER)[9]。

ER=(藥物處理組平均A值-病毒對照組平均A值)/

(細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值)×100%

(2)

4 結果

4.1 TCID50

采用致細胞病變效應(Cytopathic effect，CPE)觀測方法對流感病毒半數(shù)致死量進行判斷，結果見表1。

表1 流感病毒感染MDCK細胞CPE

由表1可知：能使半數(shù)細胞病變的病毒稀釋度在10-2～10-3，按照Reed & Muench公式計算：

距離比例=

(75%-50%)/(75%-47.1%)=0.90

(3)

log0.1(TCID50)≥50%細胞病變的病毒稀釋對數(shù)+距離比例，即log0.1(TCID50)≥2+0.90=2.90。

TCID50=10-2.9，即病毒原液稀釋10-2.9倍時，達到其TCID50。本實驗采用100倍TCID50進行實驗。

4.2 供試品細胞毒性

測定供試品各個稀釋度對MDCK細胞存活率的影響(見表2)，結果顯示不同供試品對MDCK的生長活性有不同影響，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各試藥對MDCK細胞的最大無毒質量濃度 μg·mL-1

由表2可知，全部試藥的共同無毒質量濃度為62.5 μg·mL-1， 為了排除藥物本身對實驗的影響，故選用該濃度進行實驗。

4.3 金蓮花湯及拆方各試藥抗病毒有效率

本實驗測定了金蓮花湯及拆方各個試藥和連花清瘟膠囊的抗病毒有效率。陽性藥利巴韋林組[質量濃度為2 μg·mL-1，抗病毒有效率為(65.43±0.05)%]顯示出抗病毒活性，說明該抗病毒模型可信。結果顯示，金蓮花湯具有一定的抗病毒活性，抗病毒有效率為(75.13±0.04)%，其抗病毒活性與連花清瘟膠囊[抗病毒有效率為(73.21±0.03)%]接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單味藥中抗病毒有效率最高的是大青葉，抗病毒有效率為(88.40±0.07)%，其次為葛根，抗病毒有效率為(74.27±0.06)%，然后依次為蒲公英、蘇葉、金蓮花，抗病毒有效率依次為(45.20±0.05)%、(32.20±0.07)%、(-3.26±0.09)%；在缺少1味藥的試藥中，缺少蘇葉的抗病毒有效率最高，為(51.67±0.01)%，缺金蓮花、缺蒲公英、缺大青葉、缺葛根組抗病毒有效率依次下降，分別為(28.22±0.06)%、(23.03±0.10)%、(-17.87±0.07)%、(-21.03±0.04)%。如圖1所示，葛根和連花清瘟膠囊與全方對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各試藥與全方對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

5 討論

本研究按照傳統(tǒng)用藥習慣，采用減藥法對金蓮花湯水煎液進行抗病毒活性拆方研究。結果顯示金蓮花湯具有良好的抗病毒活性，其抗病毒強度與連花清瘟膠囊接近。連花清瘟膠囊為現(xiàn)階段成熟的上市藥品，其抗病毒效果明顯[10]，因此提示金蓮花湯也有開發(fā)成良好的抗流感病毒藥物的潛力。

根據(jù)實驗結果，在試藥的共同無毒質量濃度(62.5 μg·mL-1)下，大青葉和葛根抗流感病毒活性較強，對全方的活性貢獻度較大，而蒲公英、金蓮花、蘇葉抗流感病毒活性相對較弱，對全方的活性貢獻度相對較小。葛根和大青葉的單煎液的抗流感病毒活性是單味藥中最強的，且與全方相似或高于全方，而兩者的缺味方的抗流感病毒活性明顯低于全方。雖然蒲公英、金蓮花、蘇葉對全方的活性貢獻度相對較小，但是，缺任何1味藥的金蓮花湯缺味方的抗病毒效果都比全方差。這說明各單味藥在金

注：各試藥與全方對比，*P<0.05；**P<0.01。圖1 金蓮花湯及拆方各試藥抗病毒有效率

蓮花湯中都不可或缺，也證明了金蓮花湯的組方合理性。

根據(jù)文獻報道，大青葉有良好的抗病毒活性，其對甲型流感病毒、單純性皰疹病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒、呼吸道合胞病毒、登革病毒、乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒等均有很好的抑制作用[11]，這與本研究的結果基本一致。雖然葛根單味藥的抗病毒活性未見報道，但是其富含異黃酮類化合物，主要成分葛根素具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗感染、降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、解酒等作用[12]。同時，文獻報道葛根芩連湯具有較好的抗輪狀病毒作用，加味葛根湯對臨床治療風寒表實證感冒效果良好[13-15]，說明葛根在病毒感染性疾病中可能起重要作用。

根據(jù)文獻報道，金蓮花確實具有抗病毒活性[16-17]。雖然在本研究中金蓮花單味藥表現(xiàn)出的抗流感病毒活性較差，但是其缺味方的活性明顯弱于全方，說明金蓮花對于全方的抗病毒貢獻必不可少。至于金蓮花單味藥在本研究中抗病毒活性較差的原因，我們推測可能與實驗濃度有關。這也間接印證了中藥復方的整體化協(xié)同作用方式，其具體機制值得進一步研究。