下龍灣地區(qū)根際土壤可培養(yǎng)原核微生物多樣性研究

孟曉林，丁辰龍，明紅，單金峰，吳春，聶國(guó)興*

(1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院合成生物學(xué)醫(yī)藥研究所，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來(lái)，土壤微生物多樣性研究已成為生物多樣性研究的重要領(lǐng)域[1]。有研究顯示，普通土壤中每克包含至少1010個(gè)細(xì)菌[2]，物種接近6 000～50 000個(gè)[3，4]。而在有機(jī)質(zhì)土壤中存在的生物種類(lèi)、數(shù)量更是驚人，其中細(xì)菌數(shù)量每克包含1012個(gè)，原生動(dòng)物數(shù)量每克包含104個(gè)，線蟲(chóng)數(shù)量每克包含104個(gè)[5]。因此，土壤中含有大量的微生物物種多樣性及豐富度信息，其群落構(gòu)成、生物量變化情況及所含酶活性是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)、系統(tǒng)管理及健康狀況的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。其中，以基因、物種、種群和群落作為評(píng)價(jià)土壤微生物多樣性的4個(gè)不同層面[7]。

國(guó)內(nèi)外研究表明，植物根際與根系土壤微生物的生命活動(dòng)對(duì)土壤形狀、植物對(duì)養(yǎng)分的利用與吸收、植物的生長(zhǎng)都有明顯影響[8]，根際土壤微生物類(lèi)群與植物的健康狀況也有一定的關(guān)系[9]。根際土壤微生物在調(diào)解土壤肥力、改善生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)和防治植物病蟲(chóng)害等方面均有一定的作用[10～14]。通過(guò)從根際環(huán)境樣品中篩選具有抗菌、抑菌和降解作用的有益菌來(lái)改善生態(tài)環(huán)境，日益為人們所重視。丁浩等[15]以人工蘆葦濕地為研究對(duì)象，對(duì)不同時(shí)期濕地蘆葦根際及非根際微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌群的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明蘆葦濕地根際優(yōu)勢(shì)微生物除了芽孢桿菌(Bacillus)之外，還包括假單胞菌(Pseudomonadaceae)、氣單胞菌(Aeromonas)，它們?cè)跐竦叵到y(tǒng)污水處理過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用，并以此研發(fā)出一種新型微生物制劑，利用人工接種技術(shù)改善濕地系統(tǒng)中微生物群落特征，增強(qiáng)特定微生物群落降解功能。杜小剛等[16]通過(guò)研究不同樹(shù)齡刺槐根際微生物多樣性，建議在造林時(shí)采用合適的物種和菌根真菌相結(jié)合，充分發(fā)揮菌根真菌在黃土生態(tài)退化區(qū)植被恢復(fù)中的重要作用。Teixeira等[17]則把目光投向極地環(huán)境，通過(guò)研究南極維管植物根際土壤微生物多樣性，以期擴(kuò)大微生物菌種庫(kù)(尤其是厭氧菌)，結(jié)合環(huán)境的碳循環(huán)討論分析該地環(huán)境微生物與溫室效應(yīng)及生態(tài)系統(tǒng)功能的相互影響和作用。由此，通過(guò)了解不同環(huán)境不同植被下的根際土壤微生物多樣性，對(duì)其群落微生物的功能和利用價(jià)值進(jìn)行研究，可深入剖析某一生境存在的生態(tài)問(wèn)題，著力改善生態(tài)環(huán)境。

下龍灣位于越南東北部廣寧省，屬于群島海灣區(qū)，年平均氣溫20 ℃，平均降水量為2 100 mm，土壤pH為6.0～6.5。該地區(qū)屬于典型的喀斯特地貌，擁有獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，且存在一些特殊的植被類(lèi)群，如海岸泥灘，水淹紅樹(shù)林，山腳沙灘，山坡石壁植物等。本研究以下龍灣地區(qū)采集的植物根際土壤及沙灘沉積物樣品為研究對(duì)象，基于純培養(yǎng)技術(shù)及16SrRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的細(xì)菌和放線菌進(jìn)行分析，旨在對(duì)該地區(qū)可培養(yǎng)原核微生物的多樣性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，并獲取具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品采集于越南下龍灣地區(qū)，采樣時(shí)間為秋季。根據(jù)地形確定采樣地點(diǎn)，并隨機(jī)采集12個(gè)樣品(表1)，土壤pH為6.0～6.5，標(biāo)記后裝入無(wú)菌自封袋中，試驗(yàn)室4 ℃保存待用。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基和純化培養(yǎng)基配方見(jiàn)表2和表3。

表2 分離培養(yǎng)基配方

1.3 分離試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

樣品各稱(chēng)取3 g，分別倒入三角燒瓶中，加入30 mL無(wú)菌水，并放入無(wú)菌玻璃珠，180 r·min-1振蕩1 h進(jìn)行富集培養(yǎng)。以移液器吸取1 mL懸液轉(zhuǎn)移至試管中，并加入9 mL無(wú)菌水，按此方法稀釋至10-4。

分離培養(yǎng)基的配制：依據(jù)表2分別配制分離培養(yǎng)基，并加入制霉菌素(75 mg·L-1，抑制霉菌)。

表3 純化培養(yǎng)基配方

1.3.2 菌株的分離、純化及保藏

吸取100 mL上述懸液，在不同分離培養(yǎng)基上分別進(jìn)行平板涂布，每個(gè)平板設(shè)2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)10 d；挑選形狀、顏色或大小各不相同的菌落，轉(zhuǎn)接至純化培養(yǎng)基上，對(duì)菌落編號(hào)并描述其特征；多次純化直至純化板上長(zhǎng)出單一菌落，以斜面和甘油管分別進(jìn)行保藏，斜面置于4 ℃冰箱，甘油管置于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 DNA提取及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

樣本基因組DNA提取采用酶解法與SDS-高鹽法。PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌與放線菌通用引物，上游引物F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中10×buffer 2 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板0.5 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，TaKaRa Taq0.1 μL，滅菌離子水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，參數(shù)為94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。測(cè)序序列利用BLAST和EzTaxon Server 2.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)。以具有不同分類(lèi)地位的典型菌株基因序列和同源性較高的菌株基因序列為參比，利用Clustal X軟件計(jì)算序列相似性，以MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 微生物多樣性指數(shù)計(jì)算[18]

香農(nóng)-威納(Shannon-Wienner)生物多樣性指數(shù)：

辛普森(Simpson)物種多樣性指數(shù)：

馬格列夫(Margalef)物種豐富度指數(shù)：

香農(nóng)(Shannon)物種均勻度指數(shù)：

式中，S表示微生物群落全部物種數(shù)目，Pi表示樣品中屬于第i個(gè)種的個(gè)體比例，N表示樣本中所有個(gè)體的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落多樣性分析

本試驗(yàn)基于10種分離培養(yǎng)基，共分離得到細(xì)菌和放線菌共499株，依據(jù)菌株的形狀、顏色、透明度、邊緣、凸起、濕潤(rùn)度等指標(biāo)去重復(fù)后，對(duì)其中266株進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)序。

對(duì)266株的16S rRNA基因進(jìn)行比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：下龍灣地區(qū)根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌分布于12個(gè)目，29個(gè)科，54個(gè)屬。其中，多樣性最為豐富的類(lèi)群為芽孢桿菌目(Bacillales)和放線菌目(Actinomycetales)，分別分離到8個(gè)屬和19個(gè)屬，其次是變形菌門(mén)(Proteobacteria)的根瘤菌目(Rhizobiales)和伯克氏菌目(Burkholderiales)，分別分離到6個(gè)屬和7個(gè)屬(見(jiàn)圖1a)。

在測(cè)序的266株菌株中，數(shù)量最多的為芽孢桿菌(25株)，為該地區(qū)占據(jù)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌微生物類(lèi)群。其次是鏈霉菌(19株)，為該地區(qū)占據(jù)優(yōu)勢(shì)的放線菌微生物類(lèi)群。此外，分離到杜幹氏屬(Duganella)18株；諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)13株(7個(gè)種)；根瘤菌屬(Rhizobium)12株(9個(gè)種)；節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)11株(8個(gè)種)；分枝桿菌屬(Mycobacterium)11株(7個(gè)種)；假單胞菌屬(Pseudomonas)10株(8個(gè)種)。剩余147株菌隸屬于另外46個(gè)屬(見(jiàn)圖1b)，包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)。因此，從菌株的分布情況和數(shù)量分析，該地區(qū)土壤可培養(yǎng)原核微生物優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為芽孢桿菌屬、杜幹氏菌屬和鏈霉菌屬。

基于上述測(cè)序結(jié)果，對(duì)原核微生物多樣性指數(shù)計(jì)算，結(jié)果表明，該地區(qū)多樣性指數(shù)分別為：香農(nóng)-威納生物多樣性指數(shù)H′=6.970；辛普森物種多樣性指數(shù)D=0.987；馬格列夫物種豐富度指數(shù)dMa=27.40；香農(nóng)物種均勻度指數(shù)E=1.384。

圖1 下龍灣可培養(yǎng)細(xì)菌分布

2.2 可純培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

由細(xì)菌和放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，它們主要屬于放線菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)3個(gè)門(mén)(圖2)，少數(shù)屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)，隸屬于54個(gè)屬。其中，芽孢菌屬、鏈霉菌屬及杜幹氏菌屬為該地區(qū)土壤微生物優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占測(cè)序菌株數(shù)量的9.4%、7.14%和6.77%，其余還包括諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、根瘤菌屬(Rhizobium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬，占測(cè)序菌株總數(shù)的4.89%、4.51%、4.14%、4.14%和3.76%。而其中鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬和分枝桿菌屬均為放線菌門(mén)。在所分離的菌株中，CFH84的16S rRNA基因序列相似性是94.36%，為鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)的候選新屬，CFH 60、CFH 499、CFH 483、CFH 363、CFH 308、CFH 351、CFH 326的16S rRNA基因序列相似性分別是96.8%、96.68%、96.92%、96.46%、96.41%、95.8%、96.16%，為壤霉菌屬(Agromyces)、芽孢桿菌屬、中華單胞菌屬(Sinomonas)和擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)的候選新種。

2.3 不同樣點(diǎn)細(xì)菌和放線菌多樣性分析

由圖3可知，在全部12個(gè)樣點(diǎn)中，樣點(diǎn)2中分離的微生物類(lèi)群最為豐富，占總數(shù)量的20.64%，樣點(diǎn)5及樣點(diǎn)6所獲分離菌株數(shù)量其次，占總數(shù)的18.24%和16.23%，樣點(diǎn)4及樣點(diǎn)9分離菌株數(shù)量最少，占總數(shù)的0.4%。

2.4 分離培養(yǎng)基對(duì)可培養(yǎng)微生物分離的影響

由圖4可以看出，4號(hào)、8號(hào)培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量最多，分離效果最為理想，所分離菌株占菌株總數(shù)的12.82%、12.02%。10號(hào)培養(yǎng)基分離菌株數(shù)次之，占菌株總數(shù)的11.62%。6號(hào)培養(yǎng)只分離到占總數(shù)3.81%的菌株。

3 討論

越南下龍灣地區(qū)是喀斯特地形的典型代表。迄今為止，關(guān)于越南土壤微生物多樣性的研究多集中于作物根際、河流沉積物、紅樹(shù)林及植物內(nèi)生菌等。本文采取純培養(yǎng)技術(shù)，獲取了豐富的細(xì)菌和放線菌資源，在此基礎(chǔ)上，分析該地區(qū)微生物物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)，旨在為該生境下微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。在本研究中，根際土壤常見(jiàn)的芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)均被分離出來(lái)，其中最優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為芽孢桿菌屬(Bacillus)，它可以合成降解高聚物的胞外酶、抗生素和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的化合物，在腐生營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中通常為優(yōu)勢(shì)屬[19]。此外，假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)也有較高的豐度。肖龍敏等對(duì)枸杞根際微生物群落多樣性研究結(jié)果顯示，假單胞菌屬、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)、鏈霉菌屬和分支桿菌屬(Mycobacterium)為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，與本研究結(jié)果類(lèi)似，但芽孢桿菌屬并非優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。分析原因，不同的植被覆蓋類(lèi)型對(duì)根際土壤微生物多樣性影響較大[20]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬均為植物根際土壤典型微生物，在植物分泌物和脫落物產(chǎn)生的生境條件下反應(yīng)迅速，繁殖速度很快[19]。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

本研究結(jié)果顯示，下龍灣地區(qū)根際土壤微生物的Shannon-Wienner指數(shù)及Shannon物種均勻度指數(shù)相對(duì)于其它根際土壤[16,17,21]的均較高，表明該地區(qū)微生物多樣性較高，微生物資源較為豐富。但本研究在不同的12個(gè)采樣點(diǎn)所獲得的微生物組成差異較大，其中樣點(diǎn)2占總分離微生物類(lèi)群的20.64%，而樣點(diǎn)4及樣點(diǎn)9僅占到總分離微生物類(lèi)群的0.4%。說(shuō)明在下龍灣不同的樣品采集點(diǎn)根際微生物組成差異顯著不同。Gelsomino等在不同地理位置的土壤中采集16個(gè)土壤樣本，以DGGE法分析不同生境條件下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明，微生物群落結(jié)構(gòu)在不同的土壤類(lèi)型中差異較大[22]。唐杰等[23]對(duì)若爾蓋高原濕地土壤中微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同退化階段的高原濕地土壤中微生物數(shù)量、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性均存在顯著差異。究其原因，不同樣品采集點(diǎn)的地理位置、不同類(lèi)型的土壤理化性質(zhì)(如養(yǎng)分、通氣、水分、pH等)、地上植被的種類(lèi)、生長(zhǎng)狀況及根系分泌物數(shù)量的變化，均會(huì)影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)[24]。下龍灣地區(qū)屬于喀斯特地貌的特殊地質(zhì)，其多樣化的生態(tài)系統(tǒng)、獨(dú)有的植被種類(lèi)、特殊的土壤類(lèi)型使得該地區(qū)原核微生物存在特有的結(jié)構(gòu)特征。此外，該地區(qū)植物種類(lèi)繁多，且存在一些特殊的植物群落，如海岸泥灘，山腳沙灘，山坡石壁植物等，都會(huì)很大程度上影響其根際土壤原核微生物多樣性。因此，應(yīng)根據(jù)具體情況，綜合分析下龍灣樣點(diǎn)間植物根際微生物類(lèi)群的差異及其與其它地域根際微生物類(lèi)群的差異，進(jìn)一步對(duì)于這種特殊植被覆蓋下的環(huán)境微生物存在的潛在價(jià)值開(kāi)展深入研究、評(píng)估。

目前關(guān)于根際土壤微生物的研究主要集中在其功能和利用上。丁浩[15]和吳林坤[25]等人研究發(fā)現(xiàn)根際土壤優(yōu)勢(shì)微生物除了芽孢桿菌之外，還包括假單胞菌、氣單胞菌，以此研發(fā)的新型微生物制劑，不僅可以顯著改善濕地系統(tǒng)中微生物特征，增強(qiáng)微生物降解功能，也為提高作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和防治病蟲(chóng)害提供了保障。此外，本研究利用不同類(lèi)型培養(yǎng)基對(duì)下龍灣地區(qū)根際土壤原核微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)根際土壤微生物類(lèi)群對(duì)不同碳、氮源具有選擇性。張超等對(duì)黃土高原不同植被類(lèi)型根際土壤微生物群落功能多樣性研究發(fā)現(xiàn)，不同植被根際土壤微生物碳源代謝特征不同[26]。因此，可根據(jù)下龍灣地區(qū)根際土壤微生物類(lèi)群碳、氮源代謝特征進(jìn)行植被種類(lèi)的選擇，或者根據(jù)其現(xiàn)有植被種類(lèi)，采用人工的方法對(duì)其根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而使特定根際微生物類(lèi)群選擇性增殖。綜上所述，本研究結(jié)果不僅可為判斷下龍灣地區(qū)土壤質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支撐，而且為采取合理的植被覆蓋模式、土壤經(jīng)營(yíng)模式，開(kāi)發(fā)該地區(qū)旅游資源，維護(hù)其生態(tài)平衡奠定基礎(chǔ)。

圖3 下龍灣地區(qū)不同樣點(diǎn)分離菌株的百分比

圖4 不同分離培養(yǎng)基分離下龍灣地區(qū)菌株的百分比