茄子灰霉病原菌遺傳多樣性分析

馮寶珍，李培謙

(運城學院 生命科學系，山西 運城 044000)

茄子(SolanummelongenaL)是我國重要的蔬菜作物之一，也是設施蔬菜栽培的重要種類。隨著栽培模式的改進，設施蔬菜成為現(xiàn)代農業(yè)的重要組成部分。但由于保護地空氣濕度大、種植密度大，常導致茄子灰霉病發(fā)生嚴重，已成為制約茄子質量和產量的重要因素[1]。

灰霉病主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的一類重要病害。該病原菌在世界范圍均有分布，其寄主范圍廣泛，能夠侵染大約1 000種植物[2]?；颐共≡谥参锷L過程及采后貯藏中都能發(fā)病，造成水果、蔬菜和觀賞植物組織壞死、腐爛，造成嚴重經濟損失，被列為世界第二嚴重的真菌病害[3]。

目前國內外已開始關注灰葡萄孢(B.cinerea)的種內多樣性研究。利用RAPD[4]、RFLP[5]、AFLP[6], MP-PCR[7]、微衛(wèi)星標記[8]以及DNA序列[9,10]均能證實灰霉病菌有豐富的多樣性。Ma[7]利用MP-PCR技術研究了美國佛羅里達州不同寄主上灰霉病菌遺傳結構，認為不同寄主的灰霉病菌分化程度高，菌群重組方法不一致。Leroch等[11]通過多基因測序證實德國草莓種植地灰霉菌為一個新的亞群，稱之為Botrytis group S，與B.cinerea和B.fabae親緣關系很近，而且該亞群在德國葡萄園未發(fā)現(xiàn)。劉雙清等[12]對湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳結構、分化及變異規(guī)律進行分析，認為湖南省各地草莓灰霉菌群體遺傳多樣性豐富，且遺傳差異主要來自群體內部，與地理位置關系小。張靜[13]利用形態(tài)學和分子系統(tǒng)學對湖北省作物灰霉病菌研究，病原物鑒定出14個種，主要病原為B.cinerea。張佳[14]對我國草莓主產區(qū)灰霉病多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)灰霉菌株間在培養(yǎng)性狀、交配型、轉座子類型、抗性方面均存在明顯差異。

研究灰霉菌群內多樣性對于明確田間優(yōu)勢種群及灰霉病防治具有重要意義。本研究對運城保護地茄子灰霉病菌表型多樣性和遺傳多樣性進行分析，以明確茄子灰霉病原菌優(yōu)勢種群特征，為灰霉病防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離及鑒定

供試15個茄子灰霉菌株于2017-2018年冬春季節(jié)采于山西運城鹽湖區(qū)茄子種植保護地。采用單孢分離法獲得菌株，在PDA斜面培養(yǎng)5～7 d，置于4 ℃冰箱保存。

挑取PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌絲于鋪有玻璃紙的新的PDA平板中央，放入20 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集菌絲。收集的菌絲在液氮中研磨，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(北京艾萊德生物科技有限公司)說明書提取基因組DNA。

將提取基因組DNA用于真菌ITS序列和灰葡萄孢特異序列PCR擴增，以鑒定灰葡萄孢。PCR擴增體系為：模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，共25 μL。ITS序列擴增引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),灰葡萄孢特異序列擴增引物BCF(5’-CAGGAAACACTTTTGGGGATA-3’)和BCR(5’-GAGGGACAAGAAAATCGACTAA-3’)[15]。

反應條件：預變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，共35個循環(huán)；而后72 ℃下延伸10 min；最后降為16 ℃穩(wěn)定。

1.2 生物表型分析

菌株在PDA平板培養(yǎng)3 d后，用打孔器取最邊緣的菌餅轉移到新PDA平板中央，置于20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 d。分別在24 h和48 h測量菌落直徑，并計算菌絲生長速率。每個菌株做3個重復。

計算公式:菌絲生長速率/cm·d-1=(48 h菌落直徑-24 h菌落直徑)/2。

15 d后觀察菌株菌核形成情況,并挑取菌絲制備玻片，在光學顯微鏡下觀察有無分生孢子及形態(tài)。

1.3 RAPD分子標記

本試驗使用18條隨機引物對供試菌株DNA進行遺傳多樣性初篩，篩選能產生3條帶以上、重復性好且清晰度高的引物。所用引物由上海生物工程股份有限公司合成(表1)。

將RAPD擴增體系及反應條件進行優(yōu)化。確定的反應體系為25 μL，其中ddH2O 9.5 μL，Taq Master Mix 12.5 μL，引物2 μL以及模板DNA 50 ng。擴增的反應條件為：預變性94 ℃，4 min；94 ℃，45 s，36 ℃，45 s，72 ℃，1 min，45個循環(huán)；72 ℃，10 min；最后降為4 ℃穩(wěn)定。擴增結束后，將產物用1.5%的瓊脂糖凝膠在1%的TAE緩沖液中電泳1 h，電壓120 V[16]。加入golden-view染色，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

表1 RAPD擴增引物及序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴增結果讀取多態(tài)性條帶，記錄多態(tài)性的DNA條帶數(shù)，并計算出多態(tài)性比率。將所有多態(tài)性DNA條帶中有DNA條帶的記為“1”，沒有DNA條帶的記為“0”，構建矩陣。利用POPGEN軟件(version 1.32)計算菌株的遺傳多樣性參數(shù)，主要包括觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)[17]。使用UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot生成系統(tǒng)樹[18]。

2 結果與分析

2.1 灰霉病菌株分離及鑒定

共分離純化了15個茄子灰霉病菌株，分別命名為QZBC1-15。將這15個菌株分別提取基因組DNA后，進行ITS 和灰葡萄孢特異引物擴增。15個參試菌株均能擴增出大小一致的單一條帶(圖1)，其中 ITS擴增條帶約為550 bp，BCF/R引物擴增條帶大小在300 bp左右，均與預期結果一致，說明分離純化的灰霉菌株均為灰葡萄孢(B.cinerea)。

上圖為ITS擴增結果，目的條帶在550 bp左右；下圖為灰葡萄孢特異引物BCF/R擴增結果，目的條帶大約300 bp。M為DNA分子標記；1～15為供試菌株；CK為樣性對照；- 為陰性對照

2.2 生物表型分析

將分離純化的15個灰葡萄孢菌株在PDA平板上于20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 d，前48 h測量生長速率(圖2)。15個菌株生長速率存在明顯差異，其中QZBC4生長最慢，為0.5 cm·d-1；其次是菌株QZBC2和QZBC6生長較慢；而菌株QZBC1、8及13生長較快，達到1.4 cm·d-1。

圖2 茄子灰葡萄孢菌株生長速率

參照前人劃分菌落標準[14]，將15個菌株在PDA上20 ℃培養(yǎng)30 d，其菌落主要存在4種形態(tài)(圖3)。菌絲型，不形成菌核，氣生菌絲茂盛，產孢量極少，菌株QZBC3、8、6、7、9、14和15屬于這種類型，如圖3-a所示。孢子型，每皿菌核少于10粒，其生菌絲茂盛，產孢量極大。菌株QZBC10、11、12、13屬于孢子型，如圖3-b所示。細小菌核型，菌核極小，數(shù)目極多，分散分布，產孢較多，如圖3-c 所示，菌株QZBC1、2、5屬于此類型。大菌核型，菌核鼠糞狀且數(shù)目多，呈圓形規(guī)則分布于培養(yǎng)皿中，菌絲和產孢量較少，QZBC4屬于此類型，如圖3-d所示。產菌核的菌株，繼續(xù)培養(yǎng)可在菌核上萌發(fā)產生菌絲和孢子。

圖3 菌落菌核形態(tài)及分生孢子產量情況

2.3 RAPD分析

從18條隨機引物中篩選出4條引物，這4條隨機引物的擴增條帶均在3條以上，具有很高的重復性，且清晰度高(表2)。將篩選出的4條隨機引物分別對15個茄子灰霉病菌菌株基因組DNA進行PCR擴增，擴增結果顯示片段長度范圍在175～2 000 bp，產生的總條帶數(shù)為30條，其中擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)為22條，多態(tài)性比率為73.3%。4條隨機引物分別擴增的總的條帶數(shù)中，總條帶數(shù)最多的引物為S7，擴增出11條，最少的引物為S8，擴增出5條，平均每條隨機引物擴增的總的條帶數(shù)為7.5條。

2.4 遺傳多樣性分析

將整理好的矩陣圖使用POPGEN軟件計算遺傳多樣性參數(shù)，得出觀測等位基因數(shù)(Na)為2.0000，有效等位基因數(shù)(Ne)的最高值為1.9912，最低值為1.0000，平均值為1.3708，基因多樣性指數(shù)(H)最高值為0.4978，最低值為0.0000，平均值為0.2352，Shannon指數(shù)(I)最高值為0.6909，最低值為0.0000，平均值為0.3709，其中在S7、S8、OPF-01和OPF-04這4條引物中，Ne值、H值、I值最高的引物是S7和S8，值最低的引物是OPF-01(表3)，遺傳多樣性較為豐富。

表2 篩選出的4條RAPD引物及擴增結果

表3 4條RAPD引物的遺傳多樣性參數(shù)

由圖4可以看出，在相似數(shù)0.76處，15個茄子灰葡萄孢菌株被劃成4個類群。其中Ⅰ類群有3個，為菌株QZBC1、2和5。該類型菌株均能產生細小菌核。Ⅱ類群有5個菌株有劃為2個類群，即包括孢子型菌株QZBC10、11、12和13，還包括能產生菌核的菌株 QZBC4。Ⅲ類群有3個菌株，為QZBC3、8和9；Ⅳ類群有4個菌株，為QZBC6、7、14和15，這2個類群的菌株均為菌絲型。

圖4 15個茄子灰葡萄孢菌株聚類分析圖

3 討論與結論

本研究對15株茄子灰霉病原菌遺傳多樣性進行分析，首先利用ITS引物和灰葡萄孢特異引物確定了這些菌株均為B.cinerea，然后對參試菌株的生長速率、菌落形態(tài)、菌核形成分布和產孢情況進行分析，并利用RAPD分子標記進一步分析了遺傳多樣性。15個茄子灰葡萄孢菌株表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

經過ITS引物和灰葡萄孢特異引物擴增，明確了茄子灰霉病菌均為B.cinerea，說明運城茄子灰霉病菌優(yōu)勢種為B.cinerea。其他學者研究發(fā)現(xiàn)，作物灰霉病病原除了B.cinerea外，還有B.sinoviticola和B.pelargonii等[19，20]。生長速率測定顯示15個菌株的生長速率存在明顯差異，這與前人研究結果一致[19]。張佳[14]對我國草莓灰霉病研究中發(fā)現(xiàn)，不同灰葡萄孢菌株的菌落和菌核各異，并根據(jù)產孢量、菌絲疏密情況和菌核數(shù)量分布，將菌落分為3大類型即菌絲型、孢子型和菌核型，將菌核型又細分為5種類型。本研究中15個菌株的菌落類型均在上述范圍之中，以菌絲型為主有7個菌株，孢子型和菌核型各有4個，其中大菌核型有1個，小菌核3個。后續(xù)還需要對更多灰葡萄孢菌株進行分析以明確茄子灰霉病菌菌落特征的多樣性。

張蕊等[16]利用RAPD法分析了Amphobotrysricihi的種內多樣性，從50條引物里篩選出8條引物，試驗結果顯示種內菌株存在明顯的遺傳多樣性。Kandan等[21]采用RAPD標記從50條引物里篩選出10條引物分析高粱靶斑病菌多樣性。本研究利用RAPD法從18條隨機引物里，篩選出4條引物，可用于后續(xù)茄子灰霉病菌多樣性分析。本研究中15個菌株劃分為4個類群，并且類群劃分與菌落形態(tài)有相關性，說明表型多樣性與遺傳多態(tài)性相統(tǒng)一，同時也證明了同一寄主的灰葡萄菌株間存在明顯的遺傳分化。范詠梅等[18]利用RAPD法對新疆的灰葡萄多態(tài)性進行分析，12個菌株被劃為4個類群，證明了灰霉菌株間存在遺傳分化，與本研究結果一致。

綜上所述，運城茄子灰霉病菌優(yōu)勢種為B.cinerea，種內存在形態(tài)多樣性。后續(xù)研究將對灰霉菌株的毒力和抗性差異進行分析。研究結果可為灰霉病的防控提供理論依據(jù)。