基于近場熔體靜電紡絲PCR微流控芯片的構(gòu)建與應(yīng)用

王子忠　卓少木

摘 要

本文介紹了一種利用近場熔體靜電紡絲直寫技術(shù)制作PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，英文全稱為：Polymerase chain reaction）微流控芯片的工藝。本文先介紹了利用近場熔體靜電紡絲直寫技術(shù)在導(dǎo)電玻璃上面制作PCL纖維的過程，再介紹了PCR微流控芯片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計，接著就介紹了PCL纖維的熱處理工藝以及芯片的制作方法，最后介紹了DNA提取與應(yīng)用PCR微流控芯片驗證PCR實驗的效果。

關(guān)鍵詞

近場熔體靜電紡絲;PCR;微流控

中圖分類號： P313.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.05.007

0 前言

PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，英文全稱為：Polymerase chain reaction）[1， 2]是一種可以在生物體外進行的生物反應(yīng)，能夠?qū)NA片段進行選擇性快速擴增[3，4]，在分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[5]。制作PCR微流控芯片的關(guān)鍵是微結(jié)構(gòu)的制作[6，7]，微結(jié)構(gòu)的制作方式多種多樣，例如，利用減材制造的方式，如化學(xué)腐蝕、激光加工、光刻等;利用等材制造的方式，如壓印、注塑等;利用增材制造的方式，如3D打印、近場靜電紡絲等。這些制作工藝各有其特點，化學(xué)腐蝕具有難以控制加工量的多少，會產(chǎn)生污染液，加工時間比較長的特點;激光加工需要昂貴的激光設(shè)備，制造精度由激光設(shè)備的精度決定，加工時間比較短;光刻可以加工超高精度的PCR微流控芯片[8]，但設(shè)備昂貴，工藝復(fù)雜;壓印需要制造一個對應(yīng)的模具，而模具的生產(chǎn)需要超精密加工用來實現(xiàn)，但模具難以更改;注塑可能因為模具的一些尺寸太小產(chǎn)生一些空隙、氣泡等;一般3D打印設(shè)備難以控制打印件表面質(zhì)量和形狀精度;近場熔體靜電紡絲技術(shù)是一種在高壓電場下，沉積纖維可控的技術(shù)，基于近場靜熔體靜電紡絲制作微流控芯片的微結(jié)構(gòu)精度可控，并且可以降低成本，同時還能快速根據(jù)用戶需求制作不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的微流控芯片?，F(xiàn)階段近場靜電紡絲制作微流控芯片微結(jié)構(gòu)主要是直線型或者十字交叉型微結(jié)構(gòu)，這為制作PCR微流控芯片打下了基礎(chǔ)[9]。同時，我們發(fā)現(xiàn)纖維由于熱應(yīng)力等因素的影響在冷卻過程中表面質(zhì)量會變差，為了獲得表面質(zhì)量更高的微通道，我們提出了一種近場熔體靜電紡絲纖維表面質(zhì)量改進的方法——酒精氣氛下熱處理。

2006年，孫道恒等提出近場靜電紡絲技術(shù)[10]，當接收距離在穩(wěn)定射流階段，維持PEO溶液射流所需電壓變小，纖維的沉積變得可控。他們探究了針頭液滴，聚合物溶液濃度，電壓，接收距離，速度對纖維形貌的影響。然而，纖維的形狀精度及表面質(zhì)量都不太理想在后續(xù)的研究上，孫道恒等利用PEO溶液近場電紡沉積在硅片上PEO納米纖維作為犧牲層制作了納通道，其步驟如下：在硅片上沉積納米尺寸的PEO纖維，對帶纖維的硅片鍍膜，PEO纖維氯仿超聲氯仿處理溶解，清理獲得納米通道。

2016年，廣東工業(yè)大學(xué)的梁烽基于相似的技術(shù)制作了間距為50微米的納通道，間距可控的納通道可以作為光柵此的刻線。然而電紡纖維制作的納米通道表面質(zhì)量亦不太理想。

2011年T.D Brown等提出了近場熔體靜電紡絲技術(shù)[11]，PCL在熔融狀態(tài)具備特別理想的粘度，探究了速度對射流狀態(tài)的影響，獲得有序纖維的條件：平臺運動速度大于或等于射流流動速度。2018年廣東工業(yè)大學(xué)的曾俊基于近場熔體靜電紡絲直寫技術(shù)探究了速度[12]，電壓，高度，氣壓，溫度對纖維直徑的影響，并且利用軟光刻方法制作了三種微通道，進行了液滴，層流實驗。

在本文中，基于近場熔體靜電紡絲特性，我們設(shè)計了PCR微流控的CAD圖形，進行了近場電紡。在觀測纖維形貌的過程中，我們發(fā)現(xiàn)纖維的表面質(zhì)量不好，借用本課題組用酒精配置溶液來改善表面溶液近場靜電紡絲表面質(zhì)量，提出了酒精氣氛下熱處理提高表面質(zhì)量的方法。采用軟光刻的方法使用改善表面質(zhì)量的近場電紡纖維作為PDMS微通道的模具，制作了PCR微流控芯片。最后，在制作的PCR微流控芯片上進行了相關(guān)實驗，并用電泳了PCR產(chǎn)物檢驗芯片有效性。

1 實驗材料

PDMS（polydimethylsiloxane，美國道康寧），導(dǎo)電玻璃（方阻7Ω，購于佛山晶美），PCL（poly（ε-caprolactone），Mv=80000即聚己內(nèi)酯，購于深圳易生），金黃色葡萄球菌菌株及復(fù)蘇液（ATCC25923購廣東微生物有限公司），PCR緩沖液（購于大連寶日生物科技有限公司），定制薄膜加熱系統(tǒng)（廠家上海松導(dǎo)加熱傳感器有限公司），無水乙醇（AR級，購于阿拉丁），三氯全氟辛基硅烷（AR，購于Sigma-Aldrich）。

2 紡絲過程

近場熔體靜電紡絲直寫實驗設(shè)備的主要組成部分有：壓縮氣體供氣系統(tǒng)、直流高壓電系統(tǒng)、X-Y-Z軸運動平臺、加熱系統(tǒng)、照明系統(tǒng)。紡絲過程按如下步驟：將PCL顆粒裝填滿帶有可調(diào)節(jié)溫度加熱器的料筒，料筒針頭接負極，導(dǎo)電玻璃平穩(wěn)地固定在近場熔體靜電紡絲直寫實驗設(shè)備的平臺上合適的位置上并接高壓電正極，將料筒上的加熱器溫度設(shè)置為150℃，壓縮空氣壓供氣系統(tǒng)的輸出氣壓設(shè)置為4kPa，直流高壓電系統(tǒng)的輸出電壓設(shè)置為1.5kV，X-Y-Z軸運動平臺的X與Y軸方向的運動速度設(shè)置為5mm/s，擠出熔體紡絲的噴頭末端到導(dǎo)電玻璃上表面的距離設(shè)置為0.9mm，然后根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的PCL纖維分布軌跡進行紡絲。

3 微流控芯片設(shè)計

圖1所示是所設(shè)計的PCR微流控芯片，PCR微流控芯片主要包括三個區(qū)域：C區(qū)域覆蓋的PCL纖維的溫度為92℃（用于實現(xiàn)DNA的變性）;B區(qū)域覆蓋的PCL纖維的溫度為72℃（用于實現(xiàn)DNA的延伸）;A區(qū)域覆蓋的PCL纖維的溫度為42℃（用于實現(xiàn)DNA的退火），其他相關(guān)參數(shù)的具體見于表1。

4 熱處理及芯片制作

將真空電熱恒溫爐內(nèi)部溫度加熱到50℃，保溫60min，確保干燥箱內(nèi)達到50℃，同時把無水乙醇倒入容器內(nèi)，接著把帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃按照圖2中的（c）圖的放置方式放在真空電熱恒溫爐內(nèi)部，設(shè)置電熱恒溫烘干箱加熱溫度為65℃、加熱時間為120min，使得PCL纖維在無水乙醇一直揮發(fā)的氣氛下熱處理 120min。將熱處理后的帶纖維玻璃放入真空斧內(nèi)，滴一滴三氯全氟辛基硅烷進行表面硅烷化處理，將硅烷化表面處理后的PCL纖維倒入，在50℃真空環(huán)境下固化4h;取出固化后的PDMS打孔;3.異丙醇清理PDMS表面后 將PDMS，玻璃用氧等離子處理倒，處理后貼合，并熱壓輔助鍵合。（圖2中，圖（a）是近場近場熔體靜電紡絲直寫實驗設(shè)備核心部件的示意圖，圖（b）是帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃，圖（c）是AR級無水乙醇對PCL纖維進行熱處理的示意圖（在此圖中，A是玻璃皿，B是AR級無水乙醇，C是帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃，D是放置帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃的玻璃支架，E是干燥箱;另外，實驗開始的時候，AR級無水乙醇的液面距離帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃底面距離為1mm。），圖（d）是帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃上面覆蓋有PDMS熔體冷卻后的狀態(tài)，圖（e）是冷卻成型后的帶有微流控芯片通道的PDMS倒模片，圖（f）是微流控芯片通道兩端有打孔的PDMS倒模片，圖（g）是PDMS倒模片與等面積的玻璃基板進行等離子體鍵合后的結(jié)合體，圖（h）是等離子體鍵合后的結(jié)合體在打孔的地方外接特氟龍管道接頭）。圖3所示的是近場熔體靜電紡絲直寫實驗設(shè)備核心部件的實物圖。圖4是已經(jīng)鍵合成功的PCR微流控芯片實物圖。圖5是加熱器和PCR微流控芯片連接在一起的實物圖。

5 DNA的提取

由于金黃色葡萄球菌菌株是凍干粉，需要利用細菌復(fù)蘇液對菌株進行復(fù)蘇，將菌株凍干粉與蒸餾水以體積比1：100的比例進行稀釋，再把已經(jīng)稀釋菌株的液體與復(fù)蘇液以1：10的體積比進行混合，取1ml菌株與復(fù)蘇液的混合液均勻地涂布在玻璃培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，并把培養(yǎng)皿放進電熱恒溫培養(yǎng)箱，把電熱恒溫培養(yǎng)箱調(diào)至37℃恒溫培養(yǎng)24小時。用潔凈玻璃鑷子刮取一兩個菌落放進裝有適量DNA提取液的離心管中，把離心管放置在高速離心機以12000r/min的轉(zhuǎn)速進行離心10min，舍棄上清，并置于-20℃保存。

6 結(jié)果與討論

6.1 纖維表面質(zhì)量差的形成原因

在導(dǎo)電玻璃沒加熱的前提條件下，利用近場熔體靜電紡絲直寫技術(shù)制作的PCL纖維，令PCL纖維在室溫下自然冷卻成固態(tài)，放在光學(xué)顯微鏡以10倍放大倍數(shù)進行觀察，得到圖6中（a）的觀察結(jié)果;把帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃放在加熱器上面，而加熱器放在光學(xué)顯微鏡的物鏡的平臺上，觀察PCL纖維表面的微觀結(jié)構(gòu)，其實際操作的實物圖如下圖6中（d）所示;把加熱器快速加熱到150℃，光學(xué)顯微鏡同樣以10倍放大倍數(shù)進行觀察，得到下圖6中（b）的觀察結(jié)果;把加熱器的電源斷掉，移走加熱器，把帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃放在光學(xué)顯微鏡的觀察平臺，令PCL纖維在室溫下自然冷卻成型，光學(xué)顯微鏡也同樣以10倍放大倍數(shù)進行觀察，得到下圖6中（c）的觀察結(jié)果。由實驗圖片可以知道，PCL纖維在室溫下自然冷卻成固態(tài)，纖維的微觀表面變得粗糙，表面質(zhì)量很差;重新加熱到150℃之后，PCL纖維在受熱之后變成熔融狀態(tài)，纖維的微觀表面變得光滑，表面質(zhì)量很好;受熱之后的PCL纖維再一次全部纖維同時在室溫下自然冷卻成型，此時的纖維的微觀表面變得粗糙，表面質(zhì)量較差，但是比加熱器加熱前的粗糙度小一點，表面質(zhì)量好一點。

6.2 形成熱應(yīng)力的因素

由于PCL纖維在為完全冷卻成型之前屬于彈性體，彈性體在受熱或者冷卻過程中會，體積會膨脹或者收縮，從而纖維有可能會的內(nèi)部形變與外部約束相互約束使得不能自由形變，此時就會產(chǎn)生應(yīng)力，這就是熱應(yīng)力。在熔融狀態(tài)的PCL纖維擠出的過程中，由于導(dǎo)電玻璃與空氣的比熱容不一樣，因此PCL纖維與空氣接觸的表面和與玻璃接觸的表面的散熱速度不一樣，從而會產(chǎn)生其中一部分熱應(yīng)力。由于PCL纖維擠出是有先后順序的，從而PCL纖維的冷卻成型的順序也會和擠出的先后順序一樣，同一條纖維在同一時刻的不同節(jié)段的溫度存在一定的差異，因此也會產(chǎn)生一部分熱應(yīng)力。

聚合物纖維內(nèi)外冷卻速度不一致，聚合物大分子鏈在熔融過程中形成的不平衡構(gòu)象，這種不平衡構(gòu)象在冷卻固化時不能立即恢復(fù)到與環(huán)境條件相適應(yīng)的平衡構(gòu)象。

7 基于酒精的熱處理工藝

在一些微透鏡陣列的制作過程中，人們通常利用液體的流動性以及液體表面存在表面張力的特性，對未成微透鏡形狀的點狀樹脂、PMMA等熔點較高的高分子材料采用熱回流技術(shù)使得高分子材料的形狀變成微透鏡的形狀。但是熱回流是利用加熱微透鏡陣列所在的基板，利用基板的熱傳導(dǎo)使得熔點較高的高分子材料熔融[13]，如果采用熱回流工藝就會造成低熔點PCL材料表面的溫度不均勻，而且熱回流的加熱容易控制溫度，但是冷卻時的溫度難以控制;因此，如果利用熱回流進行熱處理PCL纖維會產(chǎn)生熱應(yīng)力，難以改善PCL纖維的表面質(zhì)量。如果對PCL纖維使用熱回流技術(shù)難以改善纖維表面質(zhì)量，會使得纖維的高度降低影響PDMS的倒模成型。廈門大學(xué)的黃永芳在利用近場靜電紡絲技術(shù)制作微納通道的時候[14，15]，把PEO溶于水與乙醇的混合物中制作靜電紡絲材料，并得到質(zhì)量良好的微納通道。由于酒精具有較強的揮發(fā)性能，因此含有PEO的靜電紡絲材料能夠快速成型、能夠盡可能地減少纖維產(chǎn)生應(yīng)力而造成表面質(zhì)量很差[16]。因此，本課題的熱處理方式就利用酒精的易揮發(fā)性，把PCL纖維放置于酒精氣氛中進行熱處理。

由于PCL纖維冷卻成型后，其表面質(zhì)量比較差;從而難以滿足用來制作PCR微流控芯片的使用要求，所以要對PCL纖維表面質(zhì)量進行改善，以達到使用要求。由于PCL纖維對溫度的變化比較敏感，因此本課題選用熱處理的方式去改善PCL纖維表面質(zhì)量。對PCL纖維進行熱處理的具體方法是：把帶有PCL纖維的導(dǎo)電玻璃放在裝有AR級無水乙醇的容器的液面上空，導(dǎo)電玻璃下表面距離AR級無水乙醇的液面1mm，把裝有AR級無水乙醇的容器放進干燥箱設(shè)置不同的溫度與時間參數(shù)觀察最優(yōu)的實驗效果。

對PCL纖維進行熱處理實驗有五組，分別為：在沒有酒精氣氛環(huán)境中把真空電熱恒溫爐加熱至50℃保溫60min（圖7的c、d）、在沒有酒精氣氛環(huán)境中把真空電熱恒溫爐加熱至60℃保溫60min（圖7的e、f）、在沒有酒精氣氛環(huán)境中把真空電熱恒溫爐加熱至65℃保溫60min（圖7的g、h）、在有酒精氣氛環(huán)境中把真空電熱恒溫爐加熱至50℃保溫60min（圖7的i、j）、在有酒精氣氛環(huán)境中把真空電熱恒溫爐加熱至65℃保溫60min（圖7的k、l）。另外，圖7中的a、b是未進行熱處理之前的微觀表面圖。從下面的實驗結(jié)果圖片可以看出，在無酒精氣氛的環(huán)境中加熱至50℃保溫60min后，PCL纖維的表面質(zhì)量并沒有得到變好;在無酒精氣氛的環(huán)境中加熱至60℃保溫60min后，PCL纖維出現(xiàn)了團聚的現(xiàn)象;在無酒精氣氛的環(huán)境中加熱至65℃保溫60min后，PCL纖維的團聚現(xiàn)象更加嚴重;在有酒精氣氛的環(huán)境中加熱至50℃保溫60min后，PCL纖維的表面質(zhì)量也沒有得到變好;在有酒精氣氛的環(huán)境中加熱至60℃保溫60min后，PCL纖維的表面質(zhì)量明顯地變得很好了。在熱處理的實驗中，PCL纖維出現(xiàn)團聚現(xiàn)象的主要原因是PCL在受熱后變成熔融狀態(tài)表面張力和熱應(yīng)力同時作用使得團聚發(fā)生;而PCL纖維的表面質(zhì)量明顯地變得很好的主要原因是酒精氣氛使得熱應(yīng)力被去除了，而表面張力不足以使其團聚。

8 PCR實驗

PCR擴增：使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase（Code No.R060A）進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系的成分（其中Primer *1為CTG1095 F2，Primer *2為CTG1095 R2）比例是：CTG109 5- DNA：2×Gflex PCR Buffer（ Mg2+， dNTP plus）：Tks Gflex DNA Polymerase（1.25units/ul）：Primer*1（20uM）：Primer*2（20uM）：dH2O的體積比例為1：25：1：1：1：21。實驗操作方法：注射泵裝好需要進行PCR擴增反應(yīng)的30μL液體，其輸出管直接接PCR微流控芯片的入口處的特氟龍管道接頭，PCR微流控芯片的出口處的特氟龍管道接頭外接管道把PCR擴增的液體引流到薄壁 Eppendorf管，PID調(diào)節(jié)溫度控制器不同的控制輸出分別接到不同的溫控區(qū)域;實驗第一步為利用PID調(diào)節(jié)溫度控制器控制不同區(qū)域進行加熱，接著控制注射泵把PCR反應(yīng)體系注入PCR微流控芯片進行PCR擴增反應(yīng)。

如表2為PCR擴增所用的設(shè)計的引物名稱以及堿基序列，需要進行PCR擴增的nuc基因的正向引物以及反向引物進行擴增的起始堿基位置。理論上提取的DNA片段長度為536bp。

把PCR產(chǎn)物各取5ul進行1%瓊脂糖凝膠電泳，其電泳的電場強度大小為2V/cm，以標記DNA（M：DL2，000 DNA Marker（購于寶生物工程（大連）有限公司））的電泳條帶為參照，分析管內(nèi)的PCR擴增產(chǎn)物檢驗擴增的結(jié)果。其實驗結(jié)果圖如圖8所示，其中圖中的標號的含義分別代表M：DL2，000 DNA Marker、1：CTG1095 F2/R2 PCR產(chǎn)物（Primer *1為CTG1095 F2，Primer *2為CTG1095 R2）。

DL2，000 DNA Marker由六種不同長度的DNA片段組成，最短的四種DNA片段分別是100bp、250bp、500bp、750bp，即是如圖8所示的M列的標注的四種DNA片段?；谶@個實驗所選的實驗環(huán)境以及實驗材料，這個PCR擴增實驗理論上提取的DNA片段長度為536bp，而從圖8的DNA電泳圖結(jié)果可以看出來CTG1095 F2/R2 PCR產(chǎn)物離DL2，000 DNA Marker的500bp的DNA片段電泳中心比較相近，因此可以得出來結(jié)論是：此次PCR擴增的效果基本達到預(yù)期的效果。

9 結(jié)論

本課題利用了近場熔體靜電紡絲直寫技術(shù)在導(dǎo)電玻璃上制作PCL纖維，然后再對PCL纖維進行熱處理，提高了PCL纖維的表面質(zhì)量，接著就利用PDMS在PCL纖維上面倒模，最后把倒模出來的PDMS微流道鍵合在潔凈的導(dǎo)電玻璃上面做成PCR微流控芯片，最后驗證PCR微流控芯片的效果。最終的實驗結(jié)果表明，此課題中構(gòu)建的PCR微流控芯片效果達到預(yù)期效果，從而具有良好的市場應(yīng)用場景。

參考文獻

[1]WHITEHOUSE R B H L K.Genes and Mutations.Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology， Vol. xvi [J]. New Phytologist，52（3）： 318-20.

[2]OHAN N W，HEIKKILA J J.Reverse transcription-polymerase chain reaction：An overview of the technique and its applications[J].Biotechnology Advances，1993，11（1）： 13-29.

[3]MARKOULATOS P，SIAFAKAS N，MONCANY M.Multiplex polymerase chain reaction：A practical approach[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis，2002，16（1）： 47-51.

[4]SCHNELL S ?M C.Theoretical Description of the Polymerase Chain Reaction[J]. 1997.

[5]JIANG X，JING W，ZHENG L，et al.A continuous-flow high-throughput microfluidic device for airborne bacteria PCR detection [J].Lab on A Chip， 2014，14.

[6]HASHIMOTO M， BARANY F， XU F， et al. Serial processing of biological reactions using flow-through microfluidic devices： coupled PCR/LDR for the detection of low-abundant DNA point mutations [J]. Analyst， 2007， 132（9）： 913.

[7]KAI S，YAMAGUCHI A，ISHIDA Y，et al.A heater-integrated transparent microchannel chip for continuous-flow PCR[J].Sensors & Actuators B，2002，84（2-3）： 283-9.

[8]MAVRAKI E，MOSCHOU D，KOKKORIS G，et al.A continuous flow μPCR device with integrated microheaters on a flexible polyimide substrate[J].2011，25（none）： 1245-8.

[9]D.AHRBERG C，ANDREAS？MANZ，GEUN？CHUNG B.Polymerase chain reaction in microfluidic devices [J].Lab on A Chip，2016，16.

[10]MEI X，CHEN Q，WANG S，et al.The microscale Weissenberg effect for high-viscosity solution pumping at the picoliter level[J].Nanoscale，2018，10（15）： 7127-37.

[11]BROWN T D，DALTON P D，HUTMACHER D W. Direct writing by way of melt electrospinning [J].Adv Mater，2011，23（47）：5651-7.

[12]ZENG J，WANG H，LIN Y，et al.Fabrication of microfluidic channels based on melt-electrospinning direct writing [J].Microfluidics and Nanofluidics，2018，22（2）.

[13]邱金峰.連續(xù)無掩膜光刻與一種新型的熱回流技術(shù)用于微透鏡陣列成型[D]; 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2019.

[14]YONGFANG HUANG G Z，XIANG WANG，DAOHENG SUN.Fabrication of Micro/Nanometer-Channel by Near-Field ElectroSpinning[J].the 2011 6th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems，2011，4.

[15]ZHENG G，LI W，WANG X，et al.Precision deposition of a nanofibre by near-field electrospinning[J].Journal of Physics D：Applied Physics，2010，43（41）： 415501.

[16]FUH Y K，CHEN S Z，HE Z Y.Direct-write，highly aligned chitosan-poly（ethylene oxide） nanofiber patterns for cell morphology and spreading control[J].2013， 8（1）：97.