一株抑制單增李斯特菌感染的S. epidermidisG26菌株的分離篩選

郭 亮，張聞桐，閆帥帥，李孟華，劉 箐*, 文 一

1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093; 2. 生態(tài)環(huán)境部環(huán)境規(guī)劃院， 北京 100012

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，Lm)，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是自然界中普遍存在的一種微生物，廣泛分布在各種環(huán)境中，人類通過攝入感染Lm的食物等發(fā)生李氏桿菌病[1]。李氏桿菌病主要影響免疫力低下的老年人、孕婦和新生兒，致死率可達(dá)到20%～30%[2]。在具有免疫缺陷的宿主例如老年人或接受免疫抑制療法的病人體內(nèi)可以表現(xiàn)為敗血癥或腦膜腦炎，通過胎盤感染嬰兒表現(xiàn)為孕婦流產(chǎn)、死產(chǎn)[3]。不管是人類還是動(dòng)物，Lm可感染多種組織，包括脾、肝和腦，一般認(rèn)為L(zhǎng)m穿過腸道屏障進(jìn)入淋巴和血液，在肝細(xì)胞或脾細(xì)胞中復(fù)制并在巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖，然后通過血液可以到達(dá)大腦和胎盤[4, 5]。

隨著新型檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，Lm在食品中的檢出率大大提高，污染控制已得到極大的改善，但Lm污染導(dǎo)致人畜患病仍常有發(fā)生。Lm感染人體后，以抗生素治療為主，氨芐西林或氨芐青霉素是最佳首選藥物，對(duì)于青霉素過敏的患者使用復(fù)方新諾明[6]。傳統(tǒng)抗生素通常是抑菌或殺菌的，這意味著它們殺死或阻止病原菌的同時(shí)也會(huì)不可避免的殺死有益微生物，而抗生素的濫用也會(huì)帶來新的問題—病原菌耐藥菌株的形成、藥品不良反應(yīng)以及生態(tài)環(huán)境的破壞等[7]。因此，尋找一個(gè)能夠預(yù)防和治療Lm的新方法已經(jīng)迫在眉睫。

腸道菌群、宿主和病原菌的最新研究給我們帶來了新的思路，不同的腸道菌群組成能夠抵抗或者協(xié)助病原菌的入侵[8]。用抗生素或在無菌環(huán)境中繁殖的小鼠更易受到腸道病原菌感染，如Shigellaflexneri、Citrobacterrodentium、Lm和SalmonellaentericaserovarTyphimurium等[9, 10]。已有研究證明腸道微生物的代謝產(chǎn)物丁酸能夠有效抑制沙門氏菌的入侵，將成熟母雞體內(nèi)的腸道菌群定植到剛孵化小雞體內(nèi)被證明確實(shí)能夠有效降低沙門氏菌的感染，減少小雞體內(nèi)免疫炎癥的發(fā)生[11]。Lm的粘附蛋白(Listeria adhesion protein, LAP)能夠增加促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)來誘導(dǎo)腸上皮屏障功能發(fā)生障礙，從而促進(jìn)Lm的感染 。而腸道菌群的代謝物色胺(tryptamine)和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetate,I3A)可以降低巨噬細(xì)胞炎癥指標(biāo)，減少促炎性細(xì)胞因子的生成和抑制細(xì)胞向趨化因子遷移[12]。那么，能否利用健康宿主的腸道微生物抵御Lm的入侵甚至改善或治療Lm感染人體后造成的相關(guān)疾病或死亡？本研究對(duì)健康小鼠糞便中的腸道菌群進(jìn)行篩選、分離和培養(yǎng)，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了分離株G26能夠降低單增李斯特菌感染小鼠的死亡率，以期為治療和預(yù)防單增李斯特菌感染提供一種治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)野生株EGDe來自華中師范大學(xué)羅琴教授贈(zèng)送；6～8周齡的SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠購買自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，所有飲水和飼料均已滅菌。

腦心浸液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion，BHI)購自北京路橋技術(shù)股份有限公司，稱取37 g粉末溶于1 L去離子水中，高壓滅菌(121 ℃，15 min)后使用；固體BHI培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉，高壓滅菌(121 ℃，15 min)；李斯特菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar Listeria)購自上海欣中生物工程有限公司，稱取51.5 g基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶于1 L去離子水中，高壓滅菌(121 ℃，15 min)并暫存至50 ℃烘箱，取增補(bǔ)劑9 g加入40 mL無菌水中磁力攪拌(700r/min～1 000 r/min)30 min，混勻后倒入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并混勻，立即傾注平皿，凝固晾干后備用。

1.1.2試劑

瓊脂粉、氯化鈉(NaCl)、無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器

漩渦震蕩儀(Vortex-Genie2)購自Scientific Industries公司；生化培養(yǎng)箱(LRH-70)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；純水儀(明澈-D 24 UV)購自Millipore公司；厭氧培養(yǎng)箱購自Ruskinn公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠糞便收集

將小鼠單獨(dú)放置在酒精消毒的小盒內(nèi)自由排便，鑷子過火后收集糞便至1.5 mL無菌EP管內(nèi)，EP管放置在冰盒內(nèi)保持低溫，收集好的糞便加入無菌PBS中勻漿處理，1 000 r/min離心5 min，收集上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2單菌落的分離和篩選

糞便上清進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯笸坎加贐HI平板上，37 ℃厭氧箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)不同的單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過重新劃線純培養(yǎng)后，進(jìn)行甘油菌凍存[13, 14]。

分離出的單菌在BHI液體厭氧培養(yǎng)48 h后，6 000 r/min離心5 min收集菌體，梯度稀釋到菌濃度為(7～15)×107CFU/mL(涂平板計(jì)數(shù)得到)；單增李斯特菌EGDe接種于BHI液體37 ℃培養(yǎng)24 h后，6 000 r/min離心5 min收集菌體，梯度稀釋到菌濃度為106CFU/mL。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，共同加入200 mL BHI液體培養(yǎng)基、10 mL分離得到的單菌、10 mL EGDe，37 ℃培養(yǎng)3 h和6 h后，對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)的EGDe進(jìn)行涂平板計(jì)數(shù)，EGDe單獨(dú)添加作為對(duì)照。對(duì)有抑制效果的分離菌進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3分離菌株鑒定

分別使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增分離菌16 s基因序列，得到的DNA片段進(jìn)行產(chǎn)物純化后送華大基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAman軟件進(jìn)行拼接并使用NCBI進(jìn)行BLAST，并使用Clustal 2軟件和MEGA 7軟件進(jìn)行作圖分析。

1.2.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

20只小鼠灌胃接種1×1011CFU/只的EGDe，PBS灌胃小鼠作為對(duì)照。灌胃接種1 d后，使用分離菌進(jìn)行灌胃治療，治療劑量選擇2×108CFU/只，連續(xù)治療5 d。每天記錄小鼠死亡數(shù)量，并在治療后1 d、3 d、5 d和7 d取所有存活小鼠糞便進(jìn)行稀釋涂平板計(jì)數(shù)EGDe。在感染后第9 d麻醉脫頸處死所有存活小鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事務(wù)管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌抑制Lm生長(zhǎng)

四株分離菌分別與EGDe共同培養(yǎng)后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)EGDe的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1。與其他三株菌相比，G26菌株在3 h的共同培養(yǎng)中已經(jīng)與EGDe單獨(dú)培養(yǎng)組出現(xiàn)顯著性降低差異(P<0.05)，在共同培養(yǎng)6 h后差異更為顯著(P<0.01)。此外，G6菌株在6 h培養(yǎng)后與E組相比也出現(xiàn)顯著性差異。最終，選擇G26作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株使用。

注：對(duì)96孔板內(nèi)的Lm進(jìn)行計(jì)數(shù)，所有數(shù)據(jù)使用Student’s t test進(jìn)行顯著性分析，*=P<0.05, **=P<0.01。

圖1 分離菌抑制Lm生長(zhǎng)

2.2 分離菌G26鑒定

分離菌測(cè)序BLAST結(jié)果見表1。G26基因序列在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)后，G26的16S rDNA序列與葡萄球菌屬的16S rDNA序列相似度高達(dá)99%。通過軟件MEGA.7.0計(jì)算得出進(jìn)化樹可知，菌株G26為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(圖2)。分離菌株G26的生物學(xué)分類和一般特征見表2。

表1 G26與葡萄球菌屬模式菌株BLAST結(jié)果

表2 G26生物學(xué)分類和一般特征

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1G26治療EGDe感染BALB/c小鼠生存率

分離株G26灌胃治療感染小鼠生存率見圖3。在Lm感染后72 h小鼠開始出現(xiàn)死亡。與PBS治療相比，G26組小鼠在感染后第4 d沒有出現(xiàn)小鼠死亡。一直到第8 d，G26組小鼠死亡的數(shù)量比PBS組小鼠少3只，生存率高15%。從結(jié)果可知，分離株G26能夠降低感染小鼠的死亡率。

2.3.2G26治療EGDe感染BALB/c小鼠糞便計(jì)數(shù)

G26治療EGDe感染BALB/c小鼠糞便計(jì)數(shù)結(jié)果見圖4。治療1 d后，兩組小鼠糞便內(nèi)的Lm含量沒有顯著性差異，所有小鼠糞便內(nèi)Lm含量均在1×106CFU/g～1×106CFU/g左右。在治療后第3 d、5 d和7 d兩組的Lm含量分析仍沒有顯著性差異，但是G26組糞便內(nèi)Lm含量呈現(xiàn)出低于PBS組的趨勢(shì)?？赡茉蚴怯捎谠谥委熀?，兩組小鼠的死亡數(shù)量不同，腸道內(nèi)高含量Lm的小鼠可能已經(jīng)死亡，導(dǎo)致出現(xiàn)誤差。此外，在第7 d兩組出現(xiàn)部分小鼠體內(nèi)無Lm檢出，這也可能是造成沒有顯著性差異的原因之一，因勢(shì)?？赡茉蚴怯捎谠谥委熀?，兩組小鼠的死亡數(shù)量不同，腸道內(nèi)高含量Lm的小鼠可能已經(jīng)死亡，導(dǎo)致出現(xiàn)誤差。此外，在第7 d兩組出現(xiàn)部分小鼠體內(nèi)無Lm檢出，這也可能是造成沒有顯著性差異的原因之一，因此，接下來分析了小鼠糞便內(nèi)Lm檢出率。

注：圖2展示了分離菌G26與其他與其他親緣關(guān)系密切的菌株的位置關(guān)系。括號(hào)內(nèi)為Genbank編號(hào)，使用Clustal 2對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并在MEGA 7軟件中用最近鄰居法(Neighbor Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育推斷。比例尺代表0.002%的核苷酸序列差異。

圖2 G26系統(tǒng)發(fā)育樹

注：每個(gè)點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)分組內(nèi)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的小鼠存活率。第一階段：Lm感染階段；第二階段：灌胃治療階段；第三階段：不作任何處理，觀察階段。

2.3.3第7 d存活小鼠糞便內(nèi)Lm檢出率

第7 d存活小鼠糞便內(nèi)Lm檢出率見圖5。糞便內(nèi)Lm技術(shù)方法為涂平板計(jì)數(shù)，因此，計(jì)數(shù)方法會(huì)存在一個(gè)檢出線，在設(shè)置的濃度梯度中，最低檢出線為1×104CFU/g ，低于這個(gè)濃度的Lm無法被平板計(jì)數(shù)檢出。在小鼠感染第7 d后，部分存活小鼠體內(nèi)的Lm被清除。分析了兩組小鼠檢出率，與PBS組相比，G26組小鼠未檢出的數(shù)量更多，高于PBS組10.3%。因此，分離株G26能夠清除小鼠體內(nèi)的Lm從而治療感染小鼠。

3 結(jié)論

健康人群和小鼠對(duì)口服Lm感染具有很高的抵抗力，腸道菌群作為宿主的第一道防線，在抵抗Lm入侵方面發(fā)揮著重要作用[15]。通過抗生素處理或者飲食等擾亂腸道菌群秩序會(huì)降低宿主對(duì)Lm的抵抗能力。而使用SPF級(jí)大鼠糞便治療Lm感染小鼠后，可以顯著降低大鼠體內(nèi)Lm的載菌量。本研究通過從健康小鼠糞便中分離腸道菌群，并通過體外試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分離菌治療Lm的治療效果。分離株G26體外能夠有效抑制Lm的生長(zhǎng)、降低感染小鼠死亡率和清除感染小鼠腸道內(nèi)的Lm數(shù)量等，表明分離株G26能夠有效治療Lm感染小鼠。

圖5 第7 d存活小鼠糞便內(nèi)Lm檢出率