蘿卜硫素調(diào)控TGF-β1 /Smad信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

劉紅艷，齊 創(chuàng)

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌、肝癌及胃癌，居第4位，對(duì)人類的生命健康造成極大危害[1]。隨著醫(yī)療水平的不斷提升，結(jié)腸癌在診斷及治療方面已取得明顯進(jìn)步，但是藥物治療不僅療效不理想，而且還帶來(lái)明顯的不良反應(yīng)及結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。因此，開發(fā)更有效的化療藥物已成為抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。蘿卜硫素是一種從十字花科植物中提取的異硫氰酸鹽，研究[3-6]發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，然而蘿卜硫素抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制報(bào)道甚少。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等生物學(xué)過程，抑制TGF -β1/Smad信號(hào)通路活化可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、并誘導(dǎo)其凋亡[7-10]。本實(shí)驗(yàn)探討蘿卜硫素對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響，以期為其開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞與試劑 結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞購(gòu)自武漢巴菲爾生物有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蘿卜硫素(批號(hào)H2011265418，純度≥98%)購(gòu)于山東綠葉制藥有限公司；鼠抗人p-Smad3、Smad4、Cyclin D1及c-Myc抗體由美國(guó)CST公司提供，HRP標(biāo)記山鼠抗兔IgG由上海谷歌生物有限公司提供；HRP發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司；TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.2 儀器 BIO-RAD-550型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，BBS-V800型單人超凈臺(tái)(山東鑫貝西公司)，SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，GE-100型凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 HT-29細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2濃度的恒濕培養(yǎng)箱，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以5×104/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)組按照不同濃度10、20、40 μmol/L加入蘿卜硫素溶液，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，藥物干預(yù)24、48、72 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10 μL CCK8試劑的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度(OD)值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后，以1×105/mL的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入10、20、40 μmol/L蘿卜硫素干預(yù)細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒操作說明書分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 ELISA 收集“1.5”項(xiàng)各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組上清液中TGF β1水平。

1.7 Western blotting 收集“1.5”項(xiàng)各孔細(xì)胞，采用RIPA裂解液冰上充分裂解細(xì)胞，并測(cè)定細(xì)胞勻漿中蛋白濃度，每個(gè)樣品取50 μg蛋白上樣電泳。待蛋白完全分離后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次后將對(duì)應(yīng)條帶置于p-Smad3、Smad4、Cyclin D1及c-Myc抗體溶液(1∶3 000稀釋)中，4 ℃搖床反應(yīng)過夜。次日洗膜后將條帶置于HRP標(biāo)記IgG溶液中室溫反應(yīng)1 h，洗膜3次，HRP試劑顯影后進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響 10、20、40 μmol/L蘿卜硫素組細(xì)胞OD值相對(duì)于對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；同一濃度蘿卜硫素處理48 h和72 h，細(xì)胞OD值相比于24 h也降低(P<0.05～P<0.01)。40 μmol/L蘿卜硫素干預(yù)細(xì)胞72 h后，細(xì)胞抑制率高達(dá)76.25%，而低濃度蘿卜硫素對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制率表現(xiàn)出時(shí)間依賴性(P<0.05)(見表1)。

表1 各組間HT-29細(xì)胞OD值比較

q檢驗(yàn)：與24 h比較*P<0.05，**P<0.01；與48 h比較##P<0.01；與對(duì)照組比較++P<0.01；與蘿卜硫素10 μmol/L比較▲▲P<0.01；與蘿卜硫素20 μmol/L比較■■P<0.01

2.2 蘿卜硫素對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響 10、20、40 μmol/L蘿卜硫素干預(yù)HT-29細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.05～P<0.01)(見圖1、表2)。

2.3 蘿卜硫素對(duì)HT-29細(xì)胞TGF-β1水平的影響 ELISA結(jié)果表明，藥物處理HT-29細(xì)胞24 h，10、20、40 μmol/L蘿卜硫素組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平均低于對(duì)照組(P<0.05～P<0.01)(見表3)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與10 μmol/L蘿卜硫素比較#P<0.05，##P<0.01；與20 μmol/L蘿卜硫素比較▲P<0.05

表3 各組細(xì)胞TGF β1水平比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與10 μmol/L蘿卜硫素比較#P<0.05，##P<0.01；與20 μmol/L蘿卜硫素比較▲P<0.05

2.4 蘿卜硫素對(duì)HT-29細(xì)胞中p-Smad3、Smad4、Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，10、20、40 μmol/L蘿卜硫素均能抑制p-Smad3、Smad4、Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)(P<0.05～P<0.01)(見圖2、表4)。

3 討論

結(jié)腸癌屬于常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率較高，對(duì)人類健康威脅極大，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)全球每年約有50萬(wàn)病人死于結(jié)腸癌[11]。當(dāng)前對(duì)結(jié)腸癌的診療水平有了大幅度提升，但是其預(yù)后效果并不理想。天然中藥的有效單體成分在多種腫瘤治療中均表現(xiàn)出明顯的治療效果[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，并能誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該作用可能與蘿卜硫素下調(diào)TGF β1表達(dá)，抑制TGF β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。

采用ELISA分析HT-29細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF β1蛋白水平，結(jié)果顯示蘿卜硫素對(duì)TGF-β1表達(dá)具有抑制作用。研究[7-10]發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad信號(hào)通路在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖方面具有重要意義，可通過抑制TGF-β1蛋白表達(dá)阻滯TGFβ1/Smad信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。由此提示，蘿卜硫素對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其阻滯結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。TGF-β1/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，p-Smad3、Smad4為TGF-β1/Smad通路中重要的信號(hào)分子，其中p-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)量的改變對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞經(jīng)蘿卜硫素干預(yù)后，p-Smad3、Smad4表達(dá)水平隨之降低。相關(guān)報(bào)道[14]提出TGF-β1/Smad信號(hào)通路通過調(diào)控Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖。研究[14-16]發(fā)現(xiàn)對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路進(jìn)行抑制，能夠顯著下調(diào)Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖。此外，TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制時(shí)，Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)也隨之下降，并與p-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)的抑制具有相似的趨勢(shì)。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可通過降低TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)活性進(jìn)而抑制肝纖維化及肌肉纖維化。

表4 各組p-Smad3、Smad4、Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與10 μmol/L蘿卜硫素比較#P<0.05，##P<0.01；與20 μmol/L蘿卜硫素比較▲P<0.05

綜上，蘿卜硫素可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路分子TGF-β1、p-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)，阻滯TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而下調(diào)Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖。