益氣活血方對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MD-231細(xì)胞體外抑制作用的研究※

●盛佳鈺 吳建春 范建兵 李春陽(yáng) 董夢(mèng)婷 江 科▲

三陰性乳腺癌是乳腺癌中具有高度侵襲性生物學(xué)行為的亞型，發(fā)病年齡較小，組織學(xué)分級(jí)高，較早發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。本課題組前期對(duì)347例三陰性乳腺癌患者的隨訪顯示，其5年的無(wú)病生存率為76%，總生存率為81%，明顯低于其他類型的乳腺癌患者[2-3]。多年來(lái)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界一直在尋找三陰性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，并試圖通過(guò)開(kāi)發(fā)新的治療方法及藥物，進(jìn)一步提高療效及保持患者生活質(zhì)量，而中醫(yī)藥的發(fā)展很好的填補(bǔ)了此空缺。大量的研究證實(shí)，在乳腺癌患者治療的不同階段給予中醫(yī)藥的干預(yù)，可以有效的改善患者的免疫狀態(tài)，提高生活質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長(zhǎng)無(wú)病生存期[4-6]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論對(duì)于年輕或年老的三陰性乳腺癌患者，中藥均可以提高無(wú)病生存率[7]。近年來(lái)，“虛瘀致癌”理論逐漸被全國(guó)各地的醫(yī)家所認(rèn)同，認(rèn)為正氣不足是癌癥發(fā)生的根本原因，血瘀是癌癥發(fā)生的外在表現(xiàn)，“虛瘀致癌”是三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心病機(jī)。由此，本研究組提出了益氣活血法治療三陰性乳腺癌的治療理念。本研究采用的益氣活血法中藥復(fù)方在臨床上療效顯著，但缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究，遂利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察益氣活血方抑制MDA-MB-231增殖的作用并探討期可能的機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)益氣活血方的臨床價(jià)值奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的L15 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100 U/L 青霉素和10 mg/mL 鏈霉素。置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞貼壁情況并換液。貼壁生長(zhǎng)良好的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑 紫杉醇購(gòu)自selleck 公司（貨號(hào)S1150，規(guī)格10mM/1ml），純度99.86%，分子量853.92。

益氣活血方由黃芪、莪術(shù)按1：1比例組成。方中生藥均購(gòu)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。煎前冷水浸泡30min，武火熬開(kāi)后文火煎煮30min。采用水煎醇沉法，加入乙醇沉淀48h 后，取上層液體過(guò)0.22μm 濾膜，調(diào)整濃度配置成5g/mL 儲(chǔ)存液，置于4℃冰箱中保存。

L-15液體培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均為Gibco 公司產(chǎn)品；四甲基氮唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均購(gòu)自上海生工生物有限公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1、內(nèi)參GAPDH（均為抗兔單克隆抗體）及其相應(yīng)的二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞懸液，按照5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24h。再換為各組含藥物的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每孔200μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組：每孔只含有MDA-MB-231 細(xì)胞和培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組：每孔含有MDA-MB-231細(xì)胞、培養(yǎng)基和10nM濃度紫杉醇。益氣活血方組：每孔含有MDA-MB-231 細(xì)胞、培養(yǎng)基和濃度分別為1.5625、3.125、6.25、12.5、25 g/L 的益氣活血方中藥湯液。于處理后的0、24、48h 后，于每孔避光加入20μL的0.5%MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 溶液150μL 以溶解孔內(nèi)結(jié)晶物，采用490nm 波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫吸附儀測(cè)定各孔的OD值。

細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算方法：細(xì)胞增殖抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組光度吸收值OD 值/對(duì)照組光度吸收值OD值）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 流式細(xì)胞檢測(cè)分為4組，分別為空白對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照組：紫杉醇的濃度為10nM；益氣活血方低劑量組：濃度為3.125g/L 的益氣活血方中藥湯液。益氣活血方高劑量組：濃度為12.5g/L 的益氣活血方中藥湯液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h 用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，清洗一次，以2000 r/min 離心5min，離心后每組加入1×Annexin V Binding Buffer 100μL，充分混勻細(xì)胞，每組加入5μL FITC Annexin V染液，5μL PI染液，避光室溫反應(yīng)15min，然后每管加300μL 1×Annexin V Binding Buffer溶液，1h流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 Western Blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1的表達(dá) Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照組：紫杉醇的濃度為10nM；益氣活血方低劑量組：濃度為3.125g/L 的益氣活血方中藥湯液。益氣活血方高劑量組：濃度為12.5g/L 的益氣活血方中藥湯液。收集各組細(xì)胞后加入RIPA 裂解液，離心取上清，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，與5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10min，取30μg蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE 膠進(jìn)行分里，轉(zhuǎn)膜后將PVDF 膜用50g/L 脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，常溫封閉相應(yīng)二抗1h，用PBST到PBS過(guò)渡式洗滌3次，ECL法曝光顯影，凝膠成像儀掃描膠片并保存結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同藥物濃度組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，各劑量組與對(duì)照組間以及各劑量組間的比較均采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響倒置顯微鏡下見(jiàn)正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，多呈橢圓形或多角形，細(xì)胞體完整，胞核較大，呈卵圓形居中。濃度為12.5g/L 的益氣活血方作用于MDA-MB-231 細(xì)胞，24h 內(nèi)變化不明顯，48h 之后，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)變圓，出現(xiàn)細(xì)胞膜破損，細(xì)胞皺縮并脫落。72h后細(xì)胞變化最明顯，凋亡細(xì)胞增多，從瓶壁脫落，出現(xiàn)部分細(xì)胞碎片漂浮。見(jiàn)圖1。

圖1 12.5g/L濃度益氣活血方作用于MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)變化

2.2 益氣活血方對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖率的抑制作用采用MTT 比色法檢測(cè)益氣活血方作用于MDA-MB-231 細(xì)胞24、48h 的細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，益氣活血方對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯提高。各組增殖抑制率與空白對(duì)照組比較降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中12.5g/L、25 g/L 組的增殖抑制率與10nM 紫杉醇陽(yáng)性對(duì)照組接近，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 益氣活血方作用24、48h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑制率的影響（%，n=3，）

表1 益氣活血方作用24、48h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑制率的影響（%，n=3，）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01

2.3 益氣活血方對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，G0/G1期比例增加，S期比例逐漸降低，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而G2/M期比例卻無(wú)明顯變化，提示益氣活血方對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞阻止在G1期。見(jiàn)圖2。

2.4 Western Blot 檢測(cè)Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1的蛋白表達(dá)Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：益氣活血方作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后，與空白對(duì)照組相比，益氣活血方高劑量組（12.5 g/L）可明顯下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)的Kif15、Cyclin B1蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Cyclin D、CDK1 蛋白表達(dá)改變無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2、圖3。

圖2 益氣活血方作用24h后MDA-MB-231細(xì)胞周期變化

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌術(shù)后患者多存在正氣虧虛、瘀血內(nèi)停，其一是因手術(shù)對(duì)人體損害，致使正氣外泄，氣血受擾；其二是因?yàn)樾g(shù)后放療、化療等給人體帶來(lái)的部分副反應(yīng)，造成人體免疫功能低下，機(jī)體調(diào)節(jié)失衡，都是加重氣虛的病理因素；而腫瘤造成的瘀血狀態(tài)往往又可引起患者凝血功能異常，繼而造成新的微循環(huán)障礙，加重疾病發(fā)展[8]。對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移，中醫(yī)理論則認(rèn)為必須具備兩個(gè)條件:一是癌癥的邪氣盛，癌毒毒力旺盛導(dǎo)致氣血運(yùn)行受擾，逐漸形成瘀血；二是被轉(zhuǎn)移的器官正氣虛，“最虛之處，便是容邪之地”，正氣虛的部位就建立了轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。因此，氣虛血瘀的患者更容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移?；谝陨侠碚?，課題組在臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用益氣活血法治療三陰性乳腺癌，取得較確切的臨床療效。近年來(lái)，“虛瘀致癌”理論也逐漸被全國(guó)各地的醫(yī)家所認(rèn)同，認(rèn)為正氣不足是癌癥發(fā)生的根本原因，血瘀是癌癥發(fā)生的外在表現(xiàn)，“虛瘀致癌”是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心病機(jī)。課題組長(zhǎng)期致力于“益氣活血法”治療乳腺癌的研究，目前在研的上海市科委課題，對(duì)已完成入組的150例三陰性乳腺癌病例最長(zhǎng)26 個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)：益氣扶正聯(lián)合活血化瘀中藥組比單純益氣扶正中藥組患者有更長(zhǎng)的無(wú)病生存期（DFS），提示益氣和活血中藥聯(lián)合使用可以更好的減少侵襲性疾病的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖試驗(yàn)，探討了其抗乳腺癌可能的機(jī)制。

表2 益氣活血方對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1蛋白的表達(dá)（n=3，-x± s）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：益氣活血方可抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 增殖，使其發(fā)生不同程度的形態(tài)學(xué)改變，并且抑制作用具有劑量-時(shí)間依賴性。細(xì)胞周期的動(dòng)態(tài)平衡是維持細(xì)胞自身穩(wěn)定的重要因素，它由細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)阻滯和細(xì)胞凋亡共同調(diào)節(jié)，并需要多種胞內(nèi)和胞外信號(hào)的共同參與[8-9]。G1/S 是細(xì)胞周期細(xì)胞分裂和增殖中最重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)。如果在G1/S 期發(fā)生異常，可能導(dǎo)致正調(diào)節(jié)功能過(guò)度增強(qiáng)或負(fù)調(diào)節(jié)功能減弱或缺失，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[10]。此外，G1/S也是DNA 復(fù)制、損傷和修復(fù)的關(guān)鍵時(shí)期，當(dāng)損傷的DNA可以修復(fù)時(shí)，則繼續(xù)存活，如果DNA損傷不能有效修復(fù)，則細(xì)胞開(kāi)始凋亡程序[11-12]。本研究流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，給予益氣活血方的MDA-MB-231 細(xì)胞G0/G1 期比例增加，S 期比例逐漸降低，G2/M 期比例卻無(wú)明顯變化，提示益氣活血方可影響了MDAMB-231 細(xì)胞的周期分布，使大多數(shù)細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻礙其項(xiàng)S期轉(zhuǎn)化，阻滯了細(xì)胞的DNA合成及有絲分裂，因此抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。

圖3 益氣活血方對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白表達(dá)影響

本研究中Western blot 檢測(cè)結(jié)果提示：益氣活血方可顯著下調(diào)Cyclin B1、Kif15的表達(dá)，且具有濃度依賴性。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）是調(diào)控細(xì)胞周期的主要成分，細(xì)胞周期蛋白B1（Cyclin B1）在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，可能與激酶CDC2 形成復(fù)合物，啟動(dòng)有絲分裂，越過(guò)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，導(dǎo)致失控性的細(xì)胞增殖有關(guān)[13]。此外，有絲分裂紡錘體是癌癥化療的主要靶點(diǎn)之一，也是一些知名的抗腫瘤增殖的藥物如紫杉烷類和長(zhǎng)春花生物堿等的主要作用靶點(diǎn)[14-15]。驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）作為有絲分裂中必不可少的元件，是一類能利用ATP水解所釋放能量產(chǎn)生推力，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸或者促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)分子，在許多腫瘤中起著至關(guān)重要的作用，可用于預(yù)測(cè)癌癥的診斷和預(yù)后[16-17]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員-15（kinesin family member15，Kif15）是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族（kinesin superfamily protein）中的一員，Kif15 的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18-19]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Kif15基因表達(dá)與三陰性乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)，敲除Kif15 基因?qū)θ幮匀橄侔┘?xì)胞增殖、凋亡能力有顯著影響[21]。KIFs調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期，通過(guò)減少細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的依賴，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由G1 向S期不可逆的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖[20]。三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的有絲分裂率高，其異常增殖活躍的特性與KIFs介導(dǎo)的細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)，本課題組前期研究結(jié)果也證實(shí)，益氣活血方可顯著下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞的Kif15的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期增殖[21]。

目前，乳腺癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年增加且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，雖然新藥及臨床試驗(yàn)層出不窮，但主要針對(duì)激素依賴性乳腺癌，而對(duì)三陰乳腺癌復(fù)發(fā)耐藥及維持治療等方面并不樂(lè)觀，缺少有效既經(jīng)濟(jì)又耐受性良好的維持治療藥物。本研究結(jié)果初步證實(shí)益氣活血方能通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，本研究?jī)H僅為益氣活血法應(yīng)用于治療三陰性乳腺癌的機(jī)制探討邁出了一小步，而中藥復(fù)方的抗腫瘤作用往往多途徑，其具體作用靶點(diǎn)有待我們深入研究。