基于頂空氣相色譜-離子遷移譜的不同產(chǎn)地咖啡揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜分析

弘子姍，譚 超*，苗 玥，龔加順

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

咖啡是世界性飲料[1-2]，也是世界上主要的農(nóng)產(chǎn)品之一，在世界市場(chǎng)上的交易僅次于石油[3]。全球大部分的咖啡產(chǎn)區(qū)都位于南北回歸線(xiàn)之間的熱帶地區(qū)，有近70 個(gè)國(guó)家生產(chǎn)出口咖啡豆[4]，但產(chǎn)量、品質(zhì)和風(fēng)味卻參差不齊。苦、酸、澀、甜是咖啡的主要風(fēng)味，與風(fēng)味相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)又以油脂、蛋白質(zhì)、生物堿類(lèi)（咖啡因、葫蘆巴堿）、酸類(lèi)物質(zhì)等為主[5-6]。咖啡中的咖啡因形成咖啡風(fēng)味強(qiáng)度及苦味，在烘焙過(guò)程中其含量變化不大。Fujiokal等[7]認(rèn)為綠原酸形成咖啡的苦酸澀味，高綠原酸會(huì)降低咖啡品質(zhì)[8]?？Х戎袚]發(fā)性和非揮發(fā)性的綠原酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、乙酸、奎寧酸等形成咖啡酸味[9]。而咖啡中三酸甘油脂、萜烯、生育酚類(lèi)、甾醇類(lèi)形成了咖啡的醇厚感。多種化學(xué)物質(zhì)影響咖啡風(fēng)味，而咖啡風(fēng)味又與其品質(zhì)息息相關(guān)。目前，國(guó)際上主要通過(guò)分析香氣、酸度、風(fēng)味、醇度、余韻等指標(biāo)，杯測(cè)咖啡豆對(duì)品質(zhì)進(jìn)行評(píng)判，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)主要是美國(guó)精品咖啡協(xié)會(huì)制定的杯測(cè)體系，其中的風(fēng)味輪涵蓋了大部分咖啡口味種類(lèi)和專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)，可以幫助人們建立咖啡風(fēng)味的記憶庫(kù)，辨別咖啡味道，區(qū)分好壞。但這種體系帶有個(gè)人主觀意識(shí)，有時(shí)會(huì)給評(píng)價(jià)帶來(lái)一些偏差。目前用于風(fēng)味香氣檢測(cè)的技術(shù)主要為固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜、電子鼻和聯(lián)用技術(shù)、全二維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)、氣相色譜嗅聞分析等[10-15]，但存在氣體傳感器陣列漂移現(xiàn)象、易受外界環(huán)境因素影響、前處理復(fù)雜及應(yīng)對(duì)復(fù)雜樣品分析復(fù)雜等問(wèn)題[16-17]。Ongo等[18]研究表明咖啡品種和地理來(lái)源決定了咖啡香氣和揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）的變化，如何準(zhǔn)確用數(shù)據(jù)衡量咖啡風(fēng)味、鑒別品種和地理來(lái)源是亟待解決的難題。

氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡(jiǎn)便的氣體快檢技術(shù)[19-21]。樣品不需前處理，通過(guò)頂空進(jìn)樣快速捕捉樣品中痕量VOCs信息（低至μg/m3級(jí)別，甚至ng/m3級(jí)別），形成指紋圖譜，用于鑒別樣品的真?zhèn)巍⑿迈r度、貨架期、品種品質(zhì)區(qū)分等，GC-IMS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)樣品中物質(zhì)的二次分離，基于物質(zhì)GC保留指數(shù)和遷移時(shí)間二維交叉定性，保留指數(shù)定性和氣相色譜完全一致，均使用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合遷移時(shí)間可精準(zhǔn)定性，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。目前該技術(shù)在咖啡VOCs風(fēng)味分析中應(yīng)用較少，主要集中在毒品[22]、肉類(lèi)[23-24]、茶葉、菌類(lèi)檢測(cè)及香水研發(fā)等領(lǐng)域[25-26]。在咖啡風(fēng)味分析，特別是指紋圖譜分析鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以8 個(gè)不同地區(qū)生熟咖啡豆為實(shí)驗(yàn)材料，采用GC-IMS技術(shù)對(duì)咖啡豆中復(fù)雜VOCs進(jìn)行采集和痕量分析，利用匹配矩陣和聚類(lèi)分析，以數(shù)據(jù)可視化形式對(duì)咖啡豆品種、產(chǎn)地鑒別，以期為烘焙特征成分變化提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同產(chǎn)地咖啡豆均為全水洗法加工的咖啡豆，一部分直接打粉編號(hào)（AF、BF、CF、DF、EF、FF、GF、HF），另一部分烘焙后打粉編號(hào)（AB、BB、CB、DB、EB、FB、GB、HB）?！癆～H”代表8 種不同產(chǎn)地的咖啡，“F”代表生豆咖啡粉，“B”代表烘焙咖啡豆粉。樣品編號(hào)及對(duì)應(yīng)名稱(chēng)、栽培面積、海拔、生產(chǎn)季節(jié)、杯測(cè)風(fēng)味如表1所示。

表 1 咖啡樣品Table 1 Coffee samples used in this study

SANTOKER R500E烘焙機(jī) 北京三豆客科技有限公司；FlavourSpec?頂空（headspace，HS）-GC-IMS食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)（配有CTC自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及GC×IMS Library Search Software定性軟件） 德國(guó)G.A.S公司。

1.2 方法

1.2.1 咖啡烘焙條件

烘焙機(jī)參數(shù)：氣源為液化石油氣，火力為0.5 kPa，風(fēng)門(mén)為4，轉(zhuǎn)速為60 r/min。烘焙生豆質(zhì)量約500 g，入豆溫度180～190 ℃，烘焙時(shí)間15～20 min，中深度烘焙（Agtron控制為60～75，失水率控制為12%～15%）[27]。烘焙日期2018年8月22日。杯測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為盲測(cè)，參照美國(guó)精品咖啡協(xié)會(huì)杯測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 HS-GC-IMS測(cè)定條件

HS-GC條件：1 g樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，40 ℃孵化20 min，經(jīng)頂空進(jìn)樣200 μL用GC-IMS儀FlavourSpec?進(jìn)行測(cè)試。載氣N2（純度≥99.999%）；進(jìn)樣針溫度45 ℃；FS-SE-54-CB-1色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；載氣流量：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，20～80 mL/min；20～40 min，100～130 mL/min。

IMS條件：漂移管長(zhǎng)度98 mm；管內(nèi)線(xiàn)性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣N2（純度≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源β射線(xiàn)（氚，3H）；離子化模式：正離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)LAV和GC×IMS Library Search Software軟件分析得出樣品中VOCs的差異譜圖，并建立匹配矩陣，利用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)定性分析。采用MeV 4.9進(jìn)行3D-主成分分析（3D-principal component analysis，3D-PCA）及聚類(lèi)熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地生咖啡豆粉及對(duì)應(yīng)烘焙咖啡豆粉VOCs差異對(duì)比

圖 1 不同產(chǎn)地咖啡豆烘焙前后HS-GC-IMS譜圖比較Fig. 1 Comparison of HS-GC-IMS spectra of raw and roasted coffee powders collected from different regions

從圖1可以看出，圖譜中左側(cè)一條豎線(xiàn)為反應(yīng)離子峰（離子遷移時(shí)間約為7.81～7.89 ms）。離子峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種VOCs。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較少，黑色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。整個(gè)譜圖即代表了樣品的HS成分。

對(duì)比生熟咖啡豆粉，8 支生咖啡豆樣品烘焙后均呈現(xiàn)復(fù)雜風(fēng)味物質(zhì)體系，VOCs種類(lèi)大量增加。生咖啡豆中VOCs在1 600 s完成GC分離，30 ms內(nèi)完成IMS分離且分離度較高。而烘焙咖啡豆中VOCs在較短時(shí)間800 s完成GC分離，30 ms內(nèi)完成IMS分離且分離度高，但由于VOCs種類(lèi)較多出現(xiàn)了部分堆疊。

對(duì)比8 支不同產(chǎn)地生咖啡豆粉，由圖1A、B、C、D、E可以明顯看出，具有相同保留時(shí)間和遷移時(shí)間的VOCs，累積含量具有明顯不同，這5 個(gè)點(diǎn)可作為區(qū)分不同產(chǎn)地生咖啡豆粉的指紋特征參照點(diǎn)。生長(zhǎng)環(huán)境、品種等因素會(huì)影響生咖啡豆中醇、酸、醛、酮、酯、酚等小分子VOCs的含量，可通過(guò)VOCs的種類(lèi)增減及含量判別不同產(chǎn)地生咖啡豆。

對(duì)比8 支不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆粉，由圖1F、G、H、I、J可以明顯看出，具有相同保留時(shí)間和遷移時(shí)間的VOCs，累積含量也具有明顯不同，也可作為區(qū)分不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆粉的指紋特征參照點(diǎn)。每個(gè)指紋特征點(diǎn)對(duì)應(yīng)形成的風(fēng)味也不同，咖啡的風(fēng)味形成與咖啡豆本底品質(zhì)和烘焙有密切關(guān)系。在烘焙過(guò)程中焦糖化反應(yīng)與美拉德反應(yīng)共同作用產(chǎn)生咖啡特有的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，這些物質(zhì)包括醇、酸、醛、酮、酯、酚類(lèi)化合物等，這些風(fēng)味物質(zhì)在紅酒、果汁、奶油等食物中同樣被檢出，因此成就了烘焙咖啡特殊的花香、果香、甜香、奶油、焦糖香等特殊杯測(cè)風(fēng)味。

縱向?qū)Ρ韧划a(chǎn)地生咖啡豆粉和烘焙豆粉，由圖1K、L、M、N、O可以看出，相同保留時(shí)間和遷移時(shí)間的VOCs，烘焙后5 個(gè)特征VOCs消失，通過(guò)專(zhuān)用譜庫(kù)分析，烘焙后一些特殊的醚、醇、醛、酮、酯會(huì)減少，可作為識(shí)別生熟咖啡粉區(qū)別指紋特征點(diǎn)。

圖 2 不同產(chǎn)地生咖啡豆（A）和烘焙咖啡豆（B）HS-GC-IMS譜圖中VOCs圖庫(kù)Fig. 2 Gallery patterns of VOCs in HS-GC-IMS spectra of raw and roasted coffee beans collected from different regions

2.2 不同品種生咖啡豆粉及烘焙咖啡豆粉指紋圖譜

基于LAV軟件的Gallery Plot插件篩選的、具有明顯變化規(guī)律的8 支不同產(chǎn)地生咖啡豆粉76 種VOCs離子峰見(jiàn)圖2A，8 支不同產(chǎn)地生咖啡豆粉具有共同的VOCs，但含量不同。樣品組內(nèi)成分含量具有明顯的差異性。圖中每一行為一個(gè)咖啡樣品（每個(gè)樣品做3 個(gè)平行），由該樣品所含的全部VOCs信號(hào)峰組成，每一列為同一保留時(shí)間及遷移時(shí)間下的有機(jī)物（不同樣品中相同的物質(zhì)）的信號(hào)峰。可以看出，樣品DF的風(fēng)味物質(zhì)最為豐富，其次是HF樣品，DF樣品中濃度最高，包含苯甲醛、γ-丁內(nèi)酯、異戊酸、己醛、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2,3-丁二醇、乙偶姻、丙醇、乙酸甲酯、雙乙酰、戊醛、異丁醇等，尤其是2-戊酮，只存在于DF樣品中?？Х鹊奶卣飨銡馐怯刹煌N類(lèi)、濃度的揮發(fā)性物質(zhì)決定的[28]。印度尼西亞蘇門(mén)答臘獨(dú)特的環(huán)境和氣候賦予了曼特寧咖啡本底風(fēng)味，加之印尼式半水洗法[29]造就了DF豐富濃郁的香氣，使得DF風(fēng)味極強(qiáng)，甚至評(píng)價(jià)曼特寧厚重濃烈，是咖啡中的“愷撒大帝”，測(cè)試結(jié)果也表明DF風(fēng)味最豐富；在AF樣品中，丁酸、3-甲基丁醇、3-戊酮、丙酮的含量較高。

圖2B為篩選出的具有明顯變化規(guī)律的8 支不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆粉104 種VOCs離子峰圖。8 支不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆粉具有共同的VOCs，樣品組內(nèi)成分含量也具有一定差異性。烘焙過(guò)后的咖啡粉風(fēng)味差異較小，DB、HB樣品中己醛、2-甲基丁酸甲酯含量較高，而乙醇、乙酸乙酯、丙烯酸乙酯等物質(zhì)在BB、FB中含量較高。

2.3 樣品相似性分析

基于MeV的3D-PCA分析樣品相關(guān)性，由圖3可以看出，不同產(chǎn)地的8 支生咖啡豆粉樣品，蘇門(mén)答臘多巴湖產(chǎn)區(qū)的曼特寧DF與布隆迪產(chǎn)區(qū)咖啡豆HF的VOCs較為特別，而高晟莊園A卡蒂姆AF與巴西咖啡BF風(fēng)味相似，哥倫比亞慧蘭CF、肯尼亞AA EF、危地馬拉FF和耶加雪菲-沃卡GF的風(fēng)味較為接近，但仍有差異。

圖4表明，8 支烘焙咖啡豆粉，哥倫比亞慧蘭CB、肯尼亞AA EB、耶加雪菲-沃卡GB的VOCs較為接近，而蘇門(mén)答臘多巴湖產(chǎn)區(qū)的曼特寧DB、布隆迪產(chǎn)區(qū)咖啡豆HB、危地馬拉FB、高晟莊園A卡蒂姆AB與巴西咖啡BB風(fēng)味具有明顯差異。

圖 3 不同產(chǎn)地生咖啡豆的3D-PCA圖Fig. 3 3D-PCA plots of raw coffee beans collected from different regions

圖 4 不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆的3D-PCA圖Fig. 4 3D-PCA plots of roasted coffee beans from different regions

圖 5 生咖啡豆與烘焙咖啡豆匹配矩陣Fig. 5 Matching matrixes of raw and roasted coffee beans

圖5 匹配矩陣可以更為直觀反映樣品之間差異和區(qū)分度，圓點(diǎn)面積越大，匹配度高，表示相似程度越高，區(qū)分度越低。

從咖啡成分差異上看[30-31]，當(dāng)匹配度在85%～90%時(shí)（紅色區(qū)塊），說(shuō)明樣品中有約10%～15%的不同特征成分或成分含量明顯差異。生咖啡豆粉中DF的VOCs特征指紋與其他樣品差異明顯，有較高識(shí)別性。AF、BF、HF也能較好辨識(shí)，僅分別和EF、CF、EF有相似性。CF、EF、FF、GF較難從8 支生咖啡豆粉中辨識(shí)。烘焙咖啡豆粉中AB、BB、GB均有較好辨識(shí)度，僅分別和CB、FB、EB具有相似性。CB、DB也具有一定辨識(shí)度，EB辨識(shí)度相對(duì)較差。匹配度不小于90%（藍(lán)色區(qū)塊），8 支生咖啡豆粉之間均具有差異，烘焙豆粉也相同，表明通過(guò)HS-GC-IMS指紋特征當(dāng)匹配度不小于90%，通過(guò)譜圖中細(xì)微特征成分分析可以精確辨識(shí)咖啡豆粉產(chǎn)區(qū)。

從地域差異上看，阿拉比卡種咖啡傳播歷程大致為非洲（埃塞爾比亞）→阿拉伯半島（也門(mén)）→亞洲（印尼）→歐洲（阿姆斯特丹）→美洲（巴西）→非洲（埃塞爾比亞）。1706—1713年咖啡從印尼爪哇傳入歐洲的阿姆斯特丹植物園，隨后跨越西半球傳入美洲，中南美洲阿拉比卡咖啡種植歷史也是在1718—1790年期間。指紋圖譜數(shù)據(jù)也印證了當(dāng)匹配度在85%～90%時(shí)，南美巴西咖啡BB、南美哥倫比亞慧蘭CB、南美危地馬拉FB的VOCs特征指紋相似，3 支咖啡產(chǎn)區(qū)均為南美洲具有地域相似性。在1706—1713年咖啡傳入歐洲后，1718年又從歐洲法國(guó)傳入南美，與此同時(shí)1824年左右法國(guó)傳教士帶入越南再引入中國(guó)云南賓川。南美哥倫比亞慧蘭CB、南美危地馬拉FB、中國(guó)高晟莊園A卡蒂姆AB的VOCs特征指紋相似，3 支咖啡中產(chǎn)區(qū)2 支為南美1 支為亞洲，因種屬相似所以存在共同性。大約公元575—850年，咖啡從非洲（埃塞俄比亞）傳入阿拉伯半島（也門(mén)），1658年荷蘭人將咖啡從阿拉伯半島帶到印度，隨后傳到亞洲印尼爪哇。南非肯尼亞AA EB、南非布隆迪產(chǎn)區(qū)咖啡豆HB、東非耶加雪菲-沃卡GB和亞洲印尼曼特寧DB存在特征指紋相似性。

3 結(jié) 論

本研究以8 支不同產(chǎn)地生咖啡豆為原料，基于HSGC-IMS分析生咖啡豆粉之間、烘焙咖啡豆粉之間及生熟豆粉之間VOCs具有差異性。從指紋圖譜，3D-PCA及匹配矩陣分析可以看出，HS-GC-IMS指紋特征當(dāng)匹配度不小于90%，可通過(guò)指紋圖譜中細(xì)微特征成分的不同精確辨識(shí)生、熟咖啡豆粉產(chǎn)區(qū)。

HS-GC-IMS能夠彌補(bǔ)常規(guī)咖啡杯測(cè)帶來(lái)的不足，使得杯測(cè)更有數(shù)據(jù)依據(jù)，也能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地咖啡豆生、熟粉進(jìn)行區(qū)分，為咖啡的大數(shù)據(jù)甄別提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。