表面增強(qiáng)拉曼光譜法定性定量檢測(cè)保健食品中非法添加物西地那非

胡家勇，張 嫚，皮江一，彭青枝，馮 灝，周陶鴻,

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；3.湖北本質(zhì)檢測(cè)認(rèn)證有限公司，湖北 武漢 430000）

保健食品以其毒副作用小、安全性高、服用方便等特點(diǎn)而備受消費(fèi)者青睞。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，我國(guó)保健品市場(chǎng)獲得了空前的發(fā)展。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，一些不法分子及廠家利用人們對(duì)健康的心理需求，在各類保健品中非法添加化學(xué)藥品[1-2]，如在保健酒中加入西地那非類藥物[3-4]。西地那非以其商業(yè)名稱Viagra廣為人知，在中國(guó)俗名“偉哥”，若消費(fèi)者在長(zhǎng)期不知情條件下攝入此藥物，會(huì)對(duì)自身健康造成嚴(yán)重的危害[5]。

西地那非、他達(dá)拉非等屬壯陽類藥物，由美國(guó)輝瑞制藥公司研發(fā)，本應(yīng)屬于臨床處方藥，卻被不良酒商扣上了“藍(lán)帽子”，這類藥物具有一定副作用，具體表現(xiàn)為面部潮紅、鼻塞、頭暈頭痛和視覺異常等癥狀，如果消費(fèi)者長(zhǎng)期飲用這類“保健酒”，可導(dǎo)致其內(nèi)分泌失調(diào)和心血管功能紊亂，引起頭痛、昏厥、狂躁甚至呼吸功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)身體有隱疾的人，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死亡[6]。

目前對(duì)于保健食品中西地那非類藥物的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]、薄層色譜法[13]等，此外，酶聯(lián)免疫法[14]、紅外光譜[15-16]及離子遷移譜法[17]等都被嘗試用于保健食品中西地那非類藥物測(cè)定。色譜法在檢測(cè)的靈敏度、選擇性和高通量方面優(yōu)勢(shì)顯著，但是色譜法檢測(cè)比較費(fèi)時(shí)，且前處理方法較為繁瑣。目前法檢方法[18]檢測(cè)保健食品中西地那非類藥物存在出峰晚、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺陷，且實(shí)驗(yàn)耗材較為昂貴。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)作為一種新型的快速檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、熒光背景低、不受水干擾等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)是基于在合適頻率的入射光照射下，當(dāng)分子與納米大小的金和銀結(jié)構(gòu)相結(jié)合時(shí)，會(huì)發(fā)生表面增強(qiáng)拉曼散射，拉曼信號(hào)會(huì)強(qiáng)烈增強(qiáng)[19-20]。近年來，隨著SERS技術(shù)的發(fā)展，拉曼光譜在食品安全方面的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，如Pan Yun等[21]利用SERS法測(cè)定植物油中叔丁基對(duì)苯二酚，Gukowsky等[22]利用SERS快速鑒別人工色素和天然色素，Yang Libin等[23]利用SERS檢測(cè)牛奶中雙酚A的殘留，此外，SERS在有害小分子物質(zhì)、食源性致病菌、外源性有害物質(zhì)等方面的快速檢測(cè)也展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[24-25]，同時(shí)拉曼光譜在保健食品中非法添加那非類藥物鑒定檢測(cè)方面也有一定的應(yīng)用，如Mao Danzhuo等[26]利用SERS技術(shù)篩選保健品中西地那非和他達(dá)那非；劉元瑞等[27]利用薄層原位表面-SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)中成藥和保健品中西地那非的定性檢測(cè)；王紅梅等[28]利用SERS技術(shù)定性檢測(cè)保健品中那非類藥物；吳國(guó)萍等[29]考察不同配比納米金與不同助劑的增強(qiáng)效果，然后利用最優(yōu)增強(qiáng)試劑及助劑實(shí)現(xiàn)保健品中西地那非類藥物的定性檢測(cè)。這些報(bào)道主要利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)那非類藥物的定性檢測(cè)，針對(duì)定量檢測(cè)鮮有研究。

本研究建立一種基于SERS技術(shù)快速定性定量檢測(cè)保健食品中西地那非類非法添加物的方法，以期為保健食品中非法添加物西地那非的檢測(cè)提供新的備選方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金納米溶膠 北京倍肯恒業(yè)科技發(fā)展股份有限公司；乙酸乙酯、硫酸、氯化鈉、三聚氰胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；西地那非鹽酸鹽 中國(guó)藥品生物制品研究所。

inVia顯微共聚焦拉曼光譜儀 英國(guó)Renishaw公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取西地那非鹽酸鹽0.1 g（精確至0.000 1 g），用10 mL乙腈溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為100 mg/L。準(zhǔn)確吸取西地那非鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用0.3 mol/L的硫酸溶液將其稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列中間液，臨用時(shí)配制。分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液（50 mg/L三聚氰胺溶液）充分混勻，得到質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（因?yàn)榇郎y(cè)液也需與內(nèi)標(biāo)1∶1體積混合，所以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度默認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度）。依次向檢測(cè)瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。以西地那非質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，西地那非特征峰1 234 cm-1與三聚氰胺特征峰707 cm-1的峰高比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 定性檢測(cè)

固體：檢測(cè)膠囊類樣品時(shí)，需將膠囊殼與內(nèi)容物同時(shí)取樣研磨，其他固體樣品直接搗碎研磨[30]。稱取研磨均勻的樣品1 g于15 mL離心管中，向離心管中加入4 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集上層有機(jī)相并用乙酸乙酯定容至5 mL，此為提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL離心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集下層溶液并用水定容至5 mL，此為提取液B，依次向檢測(cè)瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL提取液B、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

液體：吸取1 mL試樣于15 mL離心管中，向離心管中加入4 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集上層有機(jī)相并定容至5 mL，上層有機(jī)相為提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL離心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集下層溶液并定容至5 mL，下層溶液為提取液B。依次向檢測(cè)瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL提取液B、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.2 定量檢測(cè)

與1.2.2.1節(jié)同法處理得到提取液B，取1 mL提取液B與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液充分混勻，此為待測(cè)液。依次向檢測(cè)瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL待測(cè)液、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 拉曼光譜儀測(cè)定條件

曝光時(shí)間5 s，激光功率25 mW，掃描次數(shù)1 次，物鏡倍數(shù)50，激光波長(zhǎng)785 nm，光柵1 200 L/mm，掃描范圍650～1 700 cm-1。

1.2.4 進(jìn)樣方式

本實(shí)驗(yàn)采用顯微共聚焦拉曼光譜儀，顯微鏡聚焦程度對(duì)儀器的檢測(cè)結(jié)果影響很大，為避免每次檢測(cè)時(shí)的反復(fù)聚焦，同時(shí)也為了確保實(shí)驗(yàn)條件的統(tǒng)一以及定量的準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示的進(jìn)樣裝置，此裝置可確保顯微鏡聚焦程度的一致性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。拉桿注射器緩慢抽吸進(jìn)樣，待樣品灌滿測(cè)試管（毛細(xì)管）后開始檢測(cè)，檢測(cè)完成后用去離子水沖洗管路，管路清洗完畢后進(jìn)行下一個(gè)樣品的檢測(cè)，避免殘留干擾。

圖 1 進(jìn)樣裝置圖Fig. 1 Drawing of injection device

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢測(cè)結(jié)果

圖 2 西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS圖Fig. 2 SERS spectrum of sidenafil standard solution

從圖2可以看出，西地那非SERS特征峰為1 234、1 525、1 579 cm-1（一階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1），與王玉等[31]的研究結(jié)果一致，空白試劑SERS特征峰位置為1 047 cm-1，與西地那非特征峰沒有干擾。

將待測(cè)樣品按相應(yīng)的前處理方式進(jìn)行處理后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)譜圖（1 234±3）、（1 525±3）cm-1和（1 580±3）cm-1處特征拉曼光譜，對(duì)保健食品中的西地那非進(jìn)行評(píng)估：若同時(shí)存在上述特征峰，則可判定樣品中含有西地那非。

西地那非標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖中，1 579 cm-1為苯環(huán)、氮雜環(huán)的C＝C與C＝N伸縮振動(dòng)歸屬，1 525、1 234 cm-1處的強(qiáng)峰為芳香化合物中＝C—H振動(dòng)峰。西地那非分子結(jié)構(gòu)中含有芳烴、雜環(huán)，分子結(jié)構(gòu)具有易于被增強(qiáng)的特點(diǎn)，因此SERS技術(shù)適用于西地那非的檢測(cè)。

2.2 定量檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 選擇內(nèi)標(biāo)法的必要性

表 1 西地那非檢測(cè)結(jié)果Table 1 Peak data showed the internal standard method to be necessary to quantify sidenafil

由表1可以看出，不同質(zhì)量濃度的西地那非特征譜峰峰位置均一致，但峰強(qiáng)與質(zhì)量濃度、峰面積與質(zhì)量濃度均呈非線性關(guān)系，因此無法直接進(jìn)行定量檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，本實(shí)驗(yàn)考慮加入一種拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)且與西地那非互無干擾的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)定量。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

圖 3 三聚氰胺與西地那非SERS圖Fig. 3 SERS spectra of melamine and sildenafil

由圖3可以看出，三聚氰胺的特征峰為707、1 091 cm-1，西地那非的特征峰為1 234、1 526、1 581 cm-1，實(shí)驗(yàn)中所用拉曼光譜儀穩(wěn)定性較好，一階光譜峰中心位置重復(fù)性不高于3 cm-1，因此三聚氰胺與西地那非的SERS峰無重疊，即三聚氰胺與西地那非之間無相互干擾；此外本實(shí)驗(yàn)研究保健食品中西地那非的定量檢測(cè)，研究對(duì)象的消費(fèi)人群為成年男士，故此類產(chǎn)品無需非法添加三聚氰胺，因此可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象不含有三聚氰胺；再者三聚氰胺具有拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)、特征峰少、峰形好等優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)選取三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行保健食品中非法添加物西地那非的定量檢測(cè)。西地那非在實(shí)際樣品中的添加水平大多在數(shù)百mg/kg，為確保定量的線性范圍，通過控制單變量的方式進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，最終確定內(nèi)標(biāo)三聚氰胺質(zhì)量濃度為50 mg/L較為合適。

2.2.3 SERS法定量檢測(cè)的可行性

本實(shí)驗(yàn)選擇加入三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)，因三聚氰胺特征峰707 cm-1峰強(qiáng)較強(qiáng)，且不會(huì)受不同質(zhì)量濃度西地那非信號(hào)峰的干擾，其峰高計(jì)算準(zhǔn)確性相對(duì)更高，故選此峰作為西地那非定量參照峰；西地那非有1 234、1 525、1 581 cm-1三個(gè)特征峰，因1 525、1 581 cm-1兩個(gè)峰存在一定的重疊，不利于計(jì)算峰高，此外，1 581 cm-1峰強(qiáng)太強(qiáng)，當(dāng)西地那非質(zhì)量濃度過高時(shí)，峰高比計(jì)算偏差大，綜合考慮選取西地那非特征峰1 234 cm-1作為定量特征峰。以西地那非質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，西地那非SERS特征峰1 234 cm-1與三聚氰胺SERS特征峰707 cm-1的峰高比（I1234/I707）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合，考慮到實(shí)際摻假樣品中西地那非類添加量達(dá)10～1 000 mg/kg，因此設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25、50 mg/L，由圖4和表2可以看出，在0～50 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系y=0.064 3x-0.051 1，R2＝0.996 9，由此可以說明SERS法定量檢測(cè)保健食品中非法添加物西地那非可行。

圖 4 西地那非定量SERS圖Fig. 4 SERS spectra obtained from quantitative determination of sildenafil

表 2 西地那非定量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results obtained from quantitative detection of sildenafil

2.2.4 加標(biāo)樣品的定量檢測(cè)結(jié)果

圖 5 固體樣品加標(biāo)SERS圖Fig. 5 SERS spectra of spiked solid samples

圖 6 液體樣品加標(biāo)SERS圖Fig. 6 SERS spectra of spiked liquid samples

取一定量的某品牌藥丸類保健品（經(jīng)法檢方法[18]檢驗(yàn)不含西地那非類藥物）搗碎研磨，精密稱取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品適量加入其中攪拌均勻，作為固體加標(biāo)樣品A，稱取3 份固體加標(biāo)樣品A，每份1.00 g，編號(hào)為A-1、A-2、A-3。吸取一定量某品牌保健酒（經(jīng)法檢方法[18]檢驗(yàn)不含西地那非藥物），添加一定量已知質(zhì)量濃度的西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為液體加標(biāo)樣品B，吸取3 份液體加標(biāo)樣品B，每份1.00 mL，編號(hào)為B-1、B-2、B-3。將固體加標(biāo)樣品A及液體加標(biāo)樣品B按待測(cè)溶液的制備與測(cè)定同法操作，加標(biāo)樣品SERS見圖5、6。計(jì)算西地那非加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示，固體加標(biāo)樣品方法的回收率為85.6%～92.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.14%，液體加標(biāo)樣品的方法回收率為98.7%～105.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.25%，加標(biāo)樣品的測(cè)試結(jié)果表明SERS法可滿足保健食品中西地那非含量的定量檢測(cè)要求。

表 3 樣品中西地那非的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of spiked samples

2.3 方法的檢測(cè)限結(jié)果

2.3.1 定性檢測(cè)限

圖 7 定性檢測(cè)限SERS圖Fig. 7 SERS spectra showing LOD

由圖7可以看出，空白僅有試劑的SERS峰出現(xiàn)，0.05、0.1、0.2 mg/L均出現(xiàn)了西地那非SERS特征光譜圖，由此說明SERS法檢測(cè)西地那非不存在假陽性，另外其定性檢測(cè)限為0.05 mg/L。

2.3.2 定量檢測(cè)限

圖 8 定量檢測(cè)限SERS圖Fig. 8 SERS spectra showing LOQ

由圖8可以看出，0、1、2.5 mg/L質(zhì)量濃度均無西地那非SERS特征光譜峰的出現(xiàn)，原因可能是內(nèi)標(biāo)三聚氰胺的質(zhì)量濃度很高，在與低質(zhì)量濃度的西地那非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合納米金時(shí)其優(yōu)勢(shì)明顯，導(dǎo)致低質(zhì)量濃度西地那非增強(qiáng)效果微弱，其特征SERS無法呈現(xiàn)，5 mg/L質(zhì)量濃度出現(xiàn)了西地那非拉曼表面增強(qiáng)特征光譜圖，定量檢測(cè)結(jié)果為4.6 mg/L。由以上結(jié)果可以看出，西地那非的定量檢測(cè)限為5 mg/L，可滿足大部分樣品的定量檢測(cè)，對(duì)于一些低含量樣品的檢測(cè)，可考慮采用氮吹的方式對(duì)提取液進(jìn)行濃縮。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 定性檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)法檢方法[18]篩選出的陽性樣本5 個(gè)，其中3 個(gè)為固體藥丸，2 個(gè)為保健酒，編號(hào)為Y-1、Y-2、Y-3、J-1、J-2。根據(jù)本研究的定性檢測(cè)方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。由圖9可以看出，5 個(gè)樣品皆出現(xiàn)了西地那非SERS特征峰，因此可以定性判定其為西地那非陽性樣品，定性結(jié)果準(zhǔn)確。

圖 9 實(shí)際樣品定性檢測(cè)結(jié)果Fig. 9 Qualitative detection of sildenafil in actual sample

2.4.2 定量檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)法檢方法[18]篩選出的陽性樣本與陰性樣本各5 個(gè)批次，隨機(jī)編號(hào)為1#～10#，按照本實(shí)驗(yàn)的樣品前處理方法對(duì)10 批次樣品進(jìn)行前處理，根據(jù)本研究的定量檢測(cè)方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。由表4可以看出，SERS法定量檢測(cè)西地那非與高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果基本一致。

表 4 實(shí)際樣品中西地那非測(cè)定Table 4 Contents of sildenafil in actual samples determined by the developed method and HPLC

因SERS法具有定性準(zhǔn)確率高、定量檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)大批量的樣品先進(jìn)行定性初篩，對(duì)于初篩的陽性樣本再進(jìn)行定量檢測(cè)，這樣可大大提高檢測(cè)效率。

2.5 實(shí)際樣品干擾分析

熒光是拉曼光譜測(cè)定的最大干擾，強(qiáng)熒光物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)，它可能掩蔽了目標(biāo)物質(zhì)的拉曼信號(hào)。保健品成分復(fù)雜，直接對(duì)保健品進(jìn)行拉曼光譜測(cè)定時(shí)可能因?yàn)楸＝∑分写嬖趶?qiáng)熒光物質(zhì)導(dǎo)致目標(biāo)物的拉曼信號(hào)無法呈現(xiàn)，因此樣品的前處理很關(guān)鍵。本研究采用二次萃取方式進(jìn)行西地那非的分離提取，樣品的萃取分離可以消除絕大部分干擾成分。除了強(qiáng)熒光物質(zhì)的干擾外，其他成分的干擾相對(duì)比較小，因?yàn)槲鞯啬欠堑奶卣鞣逵卸鄠€(gè)，而干擾物質(zhì)同時(shí)存在西地那非的特征峰可能性很低。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于SERS技術(shù)，建立了保健食品中西地那非的定性定量檢測(cè)方法。以西地那非SERS特征光譜峰實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

SERS法定性檢測(cè)保健食品中西地那非結(jié)果顯示，此法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)，可用于大量樣品的定性篩查。另外，SERS法定量測(cè)定保健食品中西地那非含量的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示：該方法檢測(cè)限為5 mg/L，線性回歸方程為y＝0.064 3x-0.051 1，R2＝0.996 9，固體試樣加標(biāo)回收率為85.6%～92.6%，液體試樣加標(biāo)回收率為103.2%～108.7%。此結(jié)果表明，SERS法定量檢測(cè)保健食品中西地那非可行。

利用SERS法與高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)對(duì)實(shí)際樣品中西地那非進(jìn)行定性定量檢測(cè)，結(jié)果佐證了SERS法定性、定量檢測(cè)保健食品中西地那非類物質(zhì)的可靠性。建立SERS法定性定量檢測(cè)保健食品中西地那非，以期為保健食品中西地那非的檢測(cè)提供新的備選方法。