Streptomyces septatus磷脂酶D在畢赤酵母中的重組表達及酶學性質(zhì)分析

黃 琳，馬杰瑩，王 爽，王 楠，MORADANA GAMAGE Rasadi Sajeewa Rajakaruna，路福平，劉逸寒

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是一種磷脂成分，其可通過直接作用于膜內(nèi)蛋白質(zhì)和膜相關(guān)蛋白質(zhì)參與多個代謝過程[1-2]，因此，PS具有多種生理功能，如提高腦細胞活力、改善記憶力、修復大腦損傷、緩解疲勞以及平衡情緒等[3-4]，不僅可以預(yù)防和治療老年癡呆癥，同時對腦萎縮、兒童多動癥和抑郁癥等的治療也具有顯著效果[5-7]，被稱為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”[8]。目前，PS已通過了美國食品藥品監(jiān)督管理局的安全認證，也已被我國原衛(wèi)生部（現(xiàn)國家衛(wèi)生健康委員會）批準為新資源食品之一[9]。因此，隨著我國大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，將具有多種生理功能的PS應(yīng)用于食品、保健品中市場潛力巨大。當前，PS的制備主要有提取法和生物酶轉(zhuǎn)化法，提取法主要以動物的大腦和肝臟以及大豆為原料，提取工藝復雜、原料利用率及純度低，且從動物組織中提取的PS也存在著一定的安全隱患[1,10]；而生物酶轉(zhuǎn)化法主要是由磷脂酶D（phospholipase D，PLD）催化天然卵磷脂，即磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸合成PS，具有綠色環(huán)保、反應(yīng)條件溫和、規(guī)?；a(chǎn)簡單等優(yōu)點，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[4,11]。

PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 種反應(yīng)：一是水解反應(yīng)，水解磷脂分子中的磷酸二酯鍵生成磷脂酸和羥基化合物；二是轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)（即轉(zhuǎn)酯反應(yīng)），催化磷脂分子末端極性基團與另一種含羥基化合物發(fā)生反應(yīng)，生成一種新的磷脂[12]。PLD的轉(zhuǎn)酯作用對磷脂的功能改性尤為重要，其可將含量豐富的PC催化合成為其他的稀有磷脂，如PS、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等[13]。由此可見，利用PLD酶法合成稀有磷脂可解決功能食品開發(fā)對高品質(zhì)磷脂的迫切需求，推動我國食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

PLD廣泛存在于植物、動物及微生物中[14]。與動植物來源的PLD相比，微生物來源的PLD易于分離、提取及生產(chǎn)。至今已報道的產(chǎn)PLD的微生物種類主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）[15]、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）[16]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[17]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[18]、大腸桿菌（Escherichia coli）[19]等。與其他來源PLD相比，鏈霉菌來源的PLD表現(xiàn)出較強的轉(zhuǎn)酯能力以及更為廣譜的底物選擇性[13]，因此，國內(nèi)外對其研究較為廣泛。Lee等[20]實現(xiàn)了Streptomycessp.YU100來源PLD在大腸桿菌中的異源表達，證明其具有轉(zhuǎn)酯活性；Zambonelli等[21]將StreptomycesPMF的PLD在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)其水解活性的最適溫度為60 ℃、最適pH值為8.0；Nakazawa等[22]分離篩選獲得1 株產(chǎn)PLD的Streptomyces racemochromogenes10-3，經(jīng)發(fā)酵純化后測定其酶學性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其在溫度50 ℃、pH 7.5時水解活力最高；Moon等[23]從土壤中分離得到了1 株產(chǎn)PLD的菌株Streptomycessp. p821，經(jīng)發(fā)酵純化后，測定其水解活性最適溫度和pH值分別為55 ℃和6.0，其轉(zhuǎn)酯活性最適溫度和pH值分別為30 ℃和5.0，表明水解和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的最適條件并不相同。由此可見，國內(nèi)外對鏈霉菌PLD主要集中在基因篩選和水解活性評估的研究中。另外，野生型鏈霉菌發(fā)酵制備PLD周期長且產(chǎn)量低，限制了其在磷脂改性方面的應(yīng)用。因此，實現(xiàn)對PLD的高效制備則尤為重要，但目前對于鏈霉菌來源PLD的異源表達主要是在大腸桿菌中進行，獲得的重組PLD一般為胞內(nèi)蛋白，后期分離純化較為困難，且容易形成包涵體，難以進一步實現(xiàn)PLD的高水平表達。Zhou Wenbin等[24]將Streptomyces mobaraensis來源PLD在大腸桿菌中進行異源表達，經(jīng)細胞破碎水解活力達到0.5 U/mL；Iwasaki等[25]在大腸桿菌中獲得Streptomyces antibioticus來源PLD包涵體，經(jīng)復性后水解活力達0.2 U/mL。為提高PLD的表達水平，研究者嘗試利用其他表達系統(tǒng)進行研究：Hou Haijuan等[26]通過核糖體結(jié)合位點、啟動子及信號肽的篩選等，實現(xiàn)了Streptomycessp.來源pld基因在Corynebacterium glutamicum中的異源表達，水解活力達到1.9 U/mL；Ogino等[27]將Streptoverticillium cinnamoneum來源pld基因在Streptomyces lividans中進行表達，水解活力為55 U/mL；Tao Xinyi等[28]進一步利用S. lividans中的誘導/組成型雙啟動子表達系統(tǒng)，實現(xiàn)Streptomyces halstedii的PLD水解活力達到68.33 U/mL。但是，到目前為止，圍繞畢赤酵母表達鏈霉菌來源PLD的報道仍較少。畢赤酵母作為常用的蛋白表達系統(tǒng)，具有產(chǎn)物表達效率高、生產(chǎn)安全無病原體、啟動子強度大、外源基因遺傳穩(wěn)定及外源蛋白可正確翻譯后修飾等特點及優(yōu)勢[29-30]，已成功實現(xiàn)了多種蛋白的表達[31]。

因此，本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)，對實驗室保存的Streptomyces septatusTCCC 21057來源的PLD進行異源表達和轉(zhuǎn)酯活性的酶學性質(zhì)分析，在此基礎(chǔ)上，對其在單水相中催化大豆PC和L-絲氨酸合成PS的條件進行優(yōu)化，以期為酶法安全高效穩(wěn)定制備PS奠定基礎(chǔ)，進一步促進PS在我國食品工業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

S. septatusTCCC 21057、克隆宿主E. coliJM109、表達宿主Pichia pastorisGS115、大腸桿菌-畢赤酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9K（＋）均為本實驗室保藏?；诋叧嘟湍该艽a子偏愛性，優(yōu)化含有S. septatusTCCC 21057來源的PLD基因（pld），所用重組質(zhì)粒pUC57-pldm由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 試劑

Pyrobest DNA聚合酶、1 kb DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI、solution I Kit 寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和切膠回收試劑盒 美國Omega BioTek有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp） 北京索萊寶科技有限公司；鎳親合樹脂（Ni-NTA） 德國Qiagen公司；胰蛋白胨和酵母提取物 美國Thermo Fisher Scientific有限公司；大豆卵磷脂（PC＞90%） 上海源葉生物科技有限公司；L-絲氨酸、膽堿氧化酶、過氧化物酶、PS 美國Sigma-Aldrich股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）固態(tài)培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固態(tài)培養(yǎng)基：酵母提取物10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L；甘油緩沖復合（buffered glycerol-complex，BMGY）培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，酵母基礎(chǔ)氮源（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，甘油10.0 mL/L、磷酸緩沖液100 mmol/L（pH 6.0）；緩沖甲醇復合培養(yǎng)基（buffered methanol-complex，BMMY）培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.04 g/L，甲醇10.0 mL/L（每日補加），磷酸緩沖液100 mmol/L（pH 6.0）；基礎(chǔ)葡萄糖（minimal dextrose，MD）培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.04 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

回旋式恒溫調(diào)速搖床、恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀 德國Eppendorf有限公司；全自動凝膠成像儀 英國Syngene有限公司；電轉(zhuǎn)儀、電泳儀和電泳槽 美國Bio-Rad有限公司；冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific有限公司；1260型高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent Technologies有限公司。

1.3 方法

1.3.1pld基因的克隆及密碼子優(yōu)化

參考已報道S. septatus來源的pld基因序列信息設(shè)計引物，引物序列為：上游引物P1：GATTCCGCCGACGGC；下游引物P2：GCCCTGGCAGAGGCC。

以S. septatusTCCC 21057基因組為模板，P1和P2為引物，進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 40 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序后，獲得pld序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性優(yōu)化該基因，獲得pld密碼子優(yōu)化基因pldm。

1.3.2 重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm的構(gòu)建

提取pUC57-pldm和pPIC9K（＋）質(zhì)粒，使用EcoRI和NotI對兩者進行雙酶切處理，經(jīng)凝膠電泳后采用切膠回收試劑盒對目的酶切產(chǎn)物進行回收，使用solution I Kit進行pldm和pPIC9K（＋）的連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliJM109克隆菌株中，利用LB-Amp平板篩選重組子，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-pldm，將重組菌株-80 ℃甘油保藏備用。

1.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)表達宿主畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)條件1.5 kV、5 ms，然后快速加入1 mL 1 mol/L的預(yù)冷山梨醇，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)1.5 h，離心收集菌體，利用100 μL山梨醇重懸菌體，涂布于MD平板，培養(yǎng)2～3 d，待其長出轉(zhuǎn)化子后，再將MD平板上生長的陽性克隆子分別點接種含G418（抗性梯度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）的YPD平板上，進行多拷貝重組菌篩選。可在2.0 mg/mL的YPD-G418平板上正常生長的菌落即為高拷貝整合菌株，挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子，接種于含有5 mL YPD培養(yǎng)基的試管，30 ℃培養(yǎng)24 h。收集菌體，利用真菌基因組提取試劑盒提取基因組，經(jīng)pPIC9K通用引物進行PCR鑒定，驗證pldm是否整合到畢赤酵母GS115的染色體上，驗證正確的重組菌株即為GS115/pPIC9K-pldm。

1.3.4 重組PLD（rPLDM）在畢赤酵母中的誘導表達

挑取GS115/pPIC9K-pldm單克隆菌落接種于液體YPD培養(yǎng)基中，220 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h。當種子液的OD600nm達到2.0～6.0，取1.0 mL接種于50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)24 h。然后4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，棄去上清液，用無菌水清洗后，轉(zhuǎn)移至50 mL BMMY培養(yǎng)基中，每隔12 h補加250 μL甲醇誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)144 h后，收集發(fā)酵上清液，即得到rPLDM酶液。在相同條件下，發(fā)酵轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的菌株GS115/pPIC9K作為空白對照。

1.3.5 rPLDM的純化

將發(fā)酵上清液使用0.22 μm濾膜過濾后，與Ni2＋瓊脂糖樹脂在4 ℃進行特異性結(jié)合1～2 h，然后轉(zhuǎn)移至經(jīng)20 mL裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4）平衡的Ni-NTA His層析柱。過柱后，用20 mL裂解緩沖液漂洗鎳柱，然后用10 mL的洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗滌雜蛋白，最后用10 mL洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4）對目的蛋白進行洗脫，收集濾過液，即為純化的rPLDM。將純化后的蛋白進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測。

1.3.6 rPLDM轉(zhuǎn)酯活力檢測

10 mL 0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.5），1.3 mmol/L PC，3.9 mmol/LL-絲氨酸和10 mmol/L CaCl2，將其裝在25 mL的錐形燒瓶中，40 ℃水浴保溫10 min，將一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液（1 mL）加入到反應(yīng)混合液中，40 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后將其加入20 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混合溶液，對PS進行萃取。轉(zhuǎn)酯活力定義：每分鐘PLD催化PC生成1 μmol PS所需的酶量為一個酶活力單位。轉(zhuǎn)酯活力計算如式（1）所示：

式中：mPS為PS產(chǎn)量/μg；n為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間/min；MPS為PS摩爾質(zhì)量（792.081 g/mol）。

HPLC檢測：萃取10 h后，取下層溶液并用0.22 μm濾膜過膜除雜質(zhì)。然后用高效液相色譜檢測PS，流動相為乙腈-甲醇-磷酸（95∶5∶0.8，V/V），硅膠柱為Venusil XBP Silica（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為205 nm，進樣量為10 μL。配制不同質(zhì)量濃度的PS（0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mg/mL）標準品，對不同濃度的PS標準品進行HPLC檢測，以PS濃度為橫坐標，響應(yīng)面積為縱坐標，繪制PS濃度標準曲線，并計算出回歸方程。最后通過標準曲線計算出PS含量。

1.3.7 rPLDM轉(zhuǎn)酯酶學性質(zhì)分析

rPLDM最適溫度測定：將反應(yīng)液體系分別置于30、40、50、60、70 ℃進行酶活力測定。每組測3 個平行，將最高酶活力作為100%，以相對酶活力作圖。

rPLDM最適pH值測定：將rPLDM分別在不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5和7.0）下進行酶活力的測定。每組測3 個平行，將最高酶活力作為100%，以相對酶活力作圖。

金屬離子：在反應(yīng)混合液中分別加入終濃度為10 mmol/L的FeCl3、FeSO4、CuCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2和CaCl2，檢測rPLDM酶活力，以無任何金屬離子添加的作為空白對照，設(shè)置值為100%，以相對酶活力作圖。

1.3.8 PS的制備條件優(yōu)化

為獲得理想的rPLDM催化PC和L-絲氨酸高效合成PS的條件，分別對反應(yīng)體系中底物物質(zhì)的量比和加酶量的條件進行了優(yōu)化。200 mL 0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 6.5）中，含有不同物質(zhì)的量比的L-絲氨酸和PC（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1）、10 mmol/L CaCl2和3.0 U/mL rPLDM，40 ℃水浴，在旋轉(zhuǎn)振動器中200 r/min反應(yīng)6 h，研究底物物質(zhì)的量比對催化合成PS的影響，確定最佳反應(yīng)的底物物質(zhì)的量比；在最佳底物物質(zhì)的量比條件下，加入不同酶量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/mL）的rPLDM進行催化反應(yīng)，研究酶量對合成PS的影響，確定最佳rPLDM用量。最后采用HPLC法分析PS生成量，利用PS的標準曲線計算PS產(chǎn)率，如式（2）所示：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗獨立重復3 次，所得數(shù)據(jù)表示為 ±s。利用SPSS 18.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析（One-way ANOVA），利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析，P＜0.05，差異顯著。折線圖采用Origin 8.0軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增及密碼子優(yōu)化

以S. septatusTCCC 21057基因組為模板，引物P1和P2，通過PCR擴增獲得目的基因pld，結(jié)果如圖1所示，目的條帶大小在1 500 bp左右，切膠回收目的基因，經(jīng)測序后獲得pld基因序列，共1 530 個堿基。根據(jù)畢赤酵母基因組密碼子偏愛性對pld基因進行優(yōu)化，由蘇州金唯智科技有限公司進行合成，獲得pldm基因。與pld相比，pldm基因序列有382 個堿基發(fā)生改變，并且GC含量由69.0%下降到52.0%。Liu Yihan等[32]實現(xiàn)了經(jīng)密碼子優(yōu)化的豬胰腺來源磷脂酶A2基因在畢赤酵母中的高效表達；張曉元等[33]對灰色鏈霉菌來源海藻糖合成酶進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶量高，且酶活力比優(yōu)化前提高了60.3%以上；Wang Jianrong等[34]將密碼子優(yōu)化后的地衣芽孢桿菌來源α-淀粉酶在畢赤酵母中進行表達，發(fā)現(xiàn)酶活力可達到優(yōu)化前的2.62 倍。由此可見，根據(jù)宿主細胞的密碼子偏好性，對外源基因進行密碼子優(yōu)化，可在一定程度上提升重組蛋白的表達水平。

圖 1 PCR擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of PLD-encoding sequence

2.2 重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm的構(gòu)建

將分別經(jīng)EcoRI和NotI處理后pldm與pPIC9K進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，利用EcoRI和NotI進行雙酶切驗證。如圖2所示，得到大小約為9 300 bp和1 500 bp的2 條片段，與預(yù)期結(jié)果一致，說明重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm構(gòu)建成功。

圖 2 重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pPIC9K-pldm

2.3 重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm整合入畢赤酵母GS115

重組質(zhì)粒pPIC9K-pldm經(jīng)SacI酶切線性化處理，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115感受后，經(jīng)MD平板篩選His＋重組轉(zhuǎn)化子，進一步經(jīng)0.5～2.0 mg/mL的G418篩選后，最終在2.0 mg/mL YPD-G418平板上獲得高拷貝重組菌株，提取其基因組，進行PCR驗證。結(jié)果如圖3所示，用pPIC9K通用引物5’AOX1和3’AOX1擴增得到的基因大小約為1 700 bp，表明目的基因pldm成功整合至畢赤酵母GS115基因組中，構(gòu)建獲得重組菌株GS115/pPIC9K-pldm。

圖 3 重組菌株GS115/pPIC9K-pldm的PCR鑒定Fig. 3 Identification of recombinant strain GS115/pPIC9K-pldm by PCR

2.4 rPLDM的表達與純化

圖 4 純化rPLDM的SDS-PAGE分析Fig. 4 Analysis of purified rPLDM by SDS-PAGE

將構(gòu)建獲得的重組菌株GS115/pPIC9K-pldm接種于YPD培養(yǎng)基中，按照1.3.4節(jié)誘導表達rPLDM，收集發(fā)酵上清液，測定其轉(zhuǎn)酯活力達2.37 U/mL。經(jīng)過鎳離子親和柱純化后獲得純化酶液，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析檢測結(jié)果如圖4所示，rPLDM分子質(zhì)量約為55 kDa，可見一條單一清晰的條帶，可用于后續(xù)的酶學性質(zhì)研究，同時，該結(jié)果表明rPLDM成功在畢赤酵母GS115中分泌表達。

2.5 轉(zhuǎn)酯酶學性質(zhì)分析

圖 5 rPLDM的酶學性質(zhì)Fig. 5 Enzymatic properties of rPLDM

由圖5A可知，rPLDM的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)最適溫度為60 ℃，在40～70 ℃范圍內(nèi)可保持60%以上酶活力；由圖5B所示，在pH 6.5時，rPLDM轉(zhuǎn)酯活力達到最高，且在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)酶活力仍可保持在80%以上；由圖5C可知，F(xiàn)e2＋和Fe3＋對rPLDM的酶活力具有強烈的抑制作用，加入Fe3＋時酶活力幾乎完全被抑制，Cu2＋和Zn2＋分別對rPLDM的酶活力具有中度和輕度的抑制作用，Na＋和K＋對其酶活力均沒有明顯的影響，Mn2＋、Mg2＋及Ca2＋對其酶活力均具有促進作用，其中Ca2＋的促進作用最為明顯，可將rPLDM的相對酶活力提高至135%。目前，國內(nèi)外研究者對不同來源PLD的特性分析主要集中在其水解活性上，Zambonelli等[21]將StreptomycesPMF的PLD在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)其水解活性的最適溫度為60 ℃、最適pH值為8.0；Nakazawa等[22]分離篩選獲得1 株

產(chǎn)PLD的S. racemochromogenes10-3，經(jīng)發(fā)酵純化后測定其酶學性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其在溫度為50 ℃、pH值為7.5時水解活力最高；并且發(fā)現(xiàn)同一PLD水解和轉(zhuǎn)酯活性的最適條件并不相同；Moon等[23]從土壤中分離得到了1 株產(chǎn)PLD的菌株Streptomycessp. p821，經(jīng)發(fā)酵純化后，測定其水解活性最適溫度和pH值分別為和55 ℃和6.0，其轉(zhuǎn)酯活性最適溫度和pH值分別為30 ℃和5.0；Simkhada等[35]對S. olivochromogenes來源的PLD進行酶學性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)酯和水解活力最適pH值均為8.0，最適溫度分別為75 ℃和50 ℃。因此，對S. septatusPLD進行轉(zhuǎn)酯活性條件的測定，可為其作用PC和絲氨酸合成PS的催化條件研究奠定基礎(chǔ)。

2.6 rPLDM單水相催化合成PS工藝優(yōu)化

2.6.1 最適底物物質(zhì)的量比的確定

圖 6 rPLDM單水相催化合成PS的條件優(yōu)化Fig. 6 Optimization of conditions for the synthesis of PS by rPLDM in a purely aqueous system

在單水相中利用rPLDM轉(zhuǎn)酯活性催化合成PS的同時，水作為反應(yīng)介質(zhì)和競爭性底物會在rPLDM的作用下與PC反應(yīng)，水解形成PA，從而影響PS的產(chǎn)率。因此，理論上可以通過過量的L-絲氨酸，提升L-絲氨酸與PC物質(zhì)的量比，使反應(yīng)平衡向轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進行，從而降低競爭性水解反應(yīng)。酶量為3.0 U/mL時，分別選擇底物L-絲氨酸與PC物質(zhì)的量比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1進行PS合成，反應(yīng)6 h后測定PS產(chǎn)率。如圖6A所示，隨著L-絲氨酸與PC物質(zhì)的量比的提升，PS的產(chǎn)率隨之增加，當物質(zhì)的量比為10∶1時，PS產(chǎn)率達到為23%，隨著底物物質(zhì)的量比的進一步增加，PS產(chǎn)率并沒有得到明顯提升，考慮催化效率及原料成本的因素，最終確定L-絲氨酸與PC物質(zhì)的量比10∶1進行后續(xù)研究。

2.6.2 最適酶添加量的確定

酶添加量在催化合成反應(yīng)過程中同樣有著重要的影響。為研究rPLDM對PS合成的影響，在L-絲氨酸與PC物質(zhì)的量比為10∶1的基礎(chǔ)上，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/mL的rPLDM進行反應(yīng)，反應(yīng)6 h后測定PS產(chǎn)率，結(jié)果如圖6B所示，PS產(chǎn)量隨著酶量的增加而顯著增加，當酶添加量為4.0 U/mL和5.0 U/mL時，PS產(chǎn)率分別達到33%和35%。綜合考慮催化效率及酶使用成本的因素，確定rPLDM添加量為4.0 U/mL。

最終，在200 mL單水相反應(yīng)體系中，40 ℃、pH 6.5（0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液）條件下，大豆PC和L-絲氨酸物質(zhì)的量比1∶10，rPLDM添加4.0 U/mL，反應(yīng)6 h后，PS產(chǎn)率可達到33%。

目前，圍繞酶法合成PS的方法主要有：1）構(gòu)建有機相/水相雙相系統(tǒng)；2）在單水相中添加表面活性劑與PC形成混合膠束體系；3）在單水相中使用硫酸鈣、二氧化硅和硅藻土作為PC吸附劑[36]。其中，對雙相合成PS的研究較多，即采用有機相（PC）和水相（L-絲氨酸和PLD）兩相催化體系，以避免PLD水解底物PC和產(chǎn)物PS生成副產(chǎn)物PA，盡管乙醚[37]、乙酸乙酯[38]、氯仿[19]、正己烷[39]、2-甲基四氫呋喃[40]和γ-纈內(nèi)酯[41]等可實現(xiàn)PS產(chǎn)率達到95%，但有機溶劑的使用難以適用于食品加工及規(guī)模生產(chǎn)中。利用表面活性劑，可與PC形成混合膠束，如在水相中添加Triton X-100、脫氧膽酸鈉和膽酸鈉分別與PC復配形成的混合膠束體系合成PS，PS產(chǎn)率分別達到94.7%、57%和56%[13,36]，但表面活性劑的使用往往會導致產(chǎn)品分離困難，并且大多數(shù)具有一定毒性，不適用于食品的生產(chǎn)[36,42]。另外，硫酸鈣、二氧化硅和硅藻土可作為PC的吸附載體，在單水相中合成PS，但存在操作較為復雜、需要能耗等問題[36,42-43]。相對水相-有機相雙相合成PS法，單水相的研究較少。盡管在PS產(chǎn)率上相較于上述合成方式相對較低，但單水相體系更適合于食品行業(yè)及規(guī)模生產(chǎn)。本研究為進一步研究單水相PLD催化PC和絲氨酸合成PS的過程中，降低PC的水解率及提高PS的生成率奠定基礎(chǔ)，從而進一步促進PS在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

3 結(jié) 論

本研究利用基因密碼子思路及畢赤酵母表達系統(tǒng)，實現(xiàn)了S. septatusTCCC 21057pld基因在畢赤酵母GS115中的高效分泌表達，搖瓶水平rPLDM酶活力可達2.37 U/mL；對rPLDM的部分酶學性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)其最適作用溫度為60 ℃、最適作用pH值為6.5；進一步對rPLDM催化應(yīng)用性能進行評估，在單水相反應(yīng)體系中，40 ℃、pH 6.5下，Ca2＋濃度10 mmol/L，大豆PC和L-絲氨酸物質(zhì)的量比1∶10，rPLDM添加4.0 U/mL，反應(yīng)6 h后，PS的產(chǎn)率可達到33%。因此，本研究為PLD的高效表達及其應(yīng)用催化合成新資源食品PS提供了技術(shù)基礎(chǔ)，在后續(xù)研究中將圍繞PLD的表達系統(tǒng)進行優(yōu)化，以進一步提升其表達水平。