嗜熱鏈球菌grx90凍干保護(hù)劑的制備

陳萱，趙瑞峰，陶志強(qiáng)，王麗，黃欣媛，陸震，印伯星，顧瑞霞，關(guān)成冉

(1.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225127；2.華熙生物科技有限公司，濟(jì)南250101；3.江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225100)

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria）是一類公認(rèn)安全并可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]，在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性。其中，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是唯一廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵的鏈球菌，其作為發(fā)酵劑在乳制品生產(chǎn)過(guò)程中起著重要的作用。隨著人民生活水平的提高，我國(guó)發(fā)酵乳制品工業(yè)的迅猛發(fā)展，發(fā)酵乳的產(chǎn)量日益增加，日益成為食品科學(xué)的研究熱點(diǎn)[2]。

隨著低溫干燥技術(shù)的發(fā)展，目前己開(kāi)發(fā)出用量小、運(yùn)輸儲(chǔ)藏方便、直接投入生產(chǎn)的多功能商品化發(fā)酵劑，即冷凍干燥發(fā)酵劑[3]。但是在實(shí)際干燥過(guò)程中依然會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞不可逆損傷，導(dǎo)致復(fù)水后菌體大量死亡。研究表明，在冷凍干燥過(guò)程中添加一定比例的保護(hù)劑能提高菌體凍干存活率[4]。保護(hù)劑一方面可以改變生物樣品冷凍干燥時(shí)的環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥對(duì)菌體細(xì)胞物理、化學(xué)損傷或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害[5]，盡可能保持菌體原有的代謝活性，另一方面可以作為支撐物在復(fù)水過(guò)程中為菌體提供一定的骨架結(jié)構(gòu)[6]。

本實(shí)驗(yàn)以本實(shí)驗(yàn)室分離出的專利菌株嗜熱鏈球菌grx90 為研究對(duì)象，以其在冷凍干燥復(fù)水后的細(xì)胞存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)凍干過(guò)程中的離心條件、凍干保護(hù)劑配方及條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高菌體在冷凍保藏過(guò)程中的存活率，為食品工業(yè)發(fā)酵劑的凍干保藏提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

JF-SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；DNP-9272 恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL2002 電子天平，梅特勒公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)EPPEENDORF 公司；FREEZONE 18L冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO 公司。

1.2 菌種

本試驗(yàn)所用嗜熱鏈球菌grx90 揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、篩選和保存的專利菌株。

1.3 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、無(wú)水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸銨2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、七水硫酸鎂0.6 g、四水硫酸錳0.3 g、吐溫80 1.0 mL、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、水1.0 L、瓊脂15.0 g。

1.4 菌體的收集

將活化2 代的嗜熱鏈球菌grx90 培養(yǎng)液離心，按照8 000 r/min、10 000 r/min、12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速分別離心8 min、10 min、12 min，離心后傾去清液，并稱重記錄，計(jì)算出菌泥獲得率。此后用生理鹽水補(bǔ)充至離心前的體積，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。通過(guò)比較離心后的細(xì)胞存活率和菌泥重量，選取在細(xì)胞存活率最大且菌體收集效果較好的離心條件下來(lái)收集菌體，供下一步試驗(yàn)用。細(xì)胞存活率和菌泥獲得率公式如下：

菌泥獲得率/%=(M1-M2)/(M3-M4)×100%

式中：M1－離心后離心管總重（g）;

M2－離心管空重（g）;

M3－終止培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)物和試管總重（g）;

M4－干試管空重（g）;

細(xì)胞存活率（%）=S1/S2×100%

式中：S1－離心后存留活菌數(shù)（cfu/mL）;

S2－離心前活菌總數(shù)（cfu/mL）。

1.5 保護(hù)劑配方優(yōu)化

1.5.1 保護(hù)劑添加物的確定

保護(hù)劑中的不同成分對(duì)于菌體有不同的保護(hù)作用，參照昝繼清等人的方法[7]并加以改動(dòng)，以12%脫脂乳為保護(hù)劑基質(zhì)，按照表1 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)添加2%醇類、0.2%鹽類、0.2%氨基酸類[4]以及10%糖類，將保護(hù)劑分別與菌泥按體積1∶1 均勻混合，裝液高度為7 mm，-80 ℃預(yù)凍12 h 后進(jìn)行凍干，計(jì)算細(xì)胞存活率來(lái)確定最適添加物。

表1 保護(hù)劑添加物

1.5.2 正交優(yōu)化

篩選出最佳各添加物后，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)以復(fù)水后的細(xì)胞存活率為指標(biāo)優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方的含量，實(shí)驗(yàn)因素水平如表2。

表2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平 %

1.6 保護(hù)劑及凍干條件的優(yōu)化

1.6.1 保護(hù)劑與菌體混合比例的優(yōu)化

利用前面所確定的最優(yōu)保護(hù)劑配方，將菌種與保護(hù)劑分別按照1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 混合，計(jì)算存活率。

1.6.2 裝液高度的優(yōu)化

裝液高度為5、6、7、8、9、10 mm 的五組樣品測(cè)定凍干前后活菌數(shù)，計(jì)算存活率篩選出最適裝液高度。

1.6.3 預(yù)凍時(shí)間的優(yōu)化

將樣品分別預(yù)凍4、8、12、16、20 h，測(cè)定凍干前后活菌數(shù)，計(jì)算存活率，篩選出最適預(yù)凍時(shí)間。

本文以零件配套生產(chǎn)問(wèn)題為例，研究了針對(duì)生產(chǎn)資源的不同屬性多角度地選擇決策變量來(lái)建立優(yōu)化生產(chǎn)模型的方法，為企業(yè)管理者提供更多的生產(chǎn)決策依據(jù)，通過(guò)實(shí)例數(shù)據(jù)及其求解也驗(yàn)證了三種模型及其優(yōu)化生產(chǎn)方案的有效性，同時(shí)也指出了各自的優(yōu)缺點(diǎn)．企業(yè)管理者可以根據(jù)本企業(yè)的實(shí)際情況合理的選取生產(chǎn)方案．

1.7 凍干存活率的測(cè)定

1.7.1 菌落計(jì)數(shù)

采用平板計(jì)數(shù)法。

1.7.2 凍干存活率的計(jì)算。

存活率（%）=凍干復(fù)水后1 mL 樣液的活菌數(shù)/凍干前1 mL樣液的活菌數(shù)×100%

1.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3 次，取平均值并采用Origin 分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 離心條件的優(yōu)化

菌體收集是發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，雖然有膜濾濃縮等更先進(jìn)的手段，但是考慮到成本以及效率的問(wèn)題，離心依然是現(xiàn)代工業(yè)菌體收集的主要方式。但是菌株在高轉(zhuǎn)速以及長(zhǎng)離心時(shí)間的環(huán)境中易受到剪切力的影響，發(fā)生細(xì)胞破碎導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低[8]。本部分?jǐn)M通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間獲得最佳離心條件，結(jié)果如表3所示。

由表3 可知，嗜熱鏈球菌grx90 細(xì)胞存活率隨著轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間的的增加而降低，菌泥獲得率隨著轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間的增加而提高。王順余等[9]在探究?jī)龈蓷l件對(duì)于雙歧桿菌存活率的影響時(shí)觀點(diǎn)一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其他條件相比菌泥獲得率總體差距不大，而離心時(shí)間為8 min 時(shí)，細(xì)胞存活率最高。因此選擇轉(zhuǎn)速為8 000 r/min、離心時(shí)間為8 min 來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 保護(hù)劑配方優(yōu)化

醇類屬于小分子滲透型保護(hù)劑[10]，其親水能力強(qiáng)且可以透過(guò)細(xì)胞膜，使細(xì)胞中溶質(zhì)濃度上升從而抑制冰晶生成[11]。因此選取4 種醇類進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以復(fù)水后細(xì)胞存活率為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 保護(hù)劑中醇類的確定及山梨醇含量的確定

由圖1（a）可知，山梨醇、甘油、甘露醇對(duì)于嗜熱鏈球菌grx90 在凍干過(guò)程中細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。以山梨醇作為保護(hù)劑添加劑計(jì)算凍干后所得的細(xì)胞存活率最高，為55.32%。因此選取山梨醇作為醇類添加物，并對(duì)山梨醇進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)以確定最佳添加量來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。如圖1（b）所示，當(dāng)選取3%濃度山梨醇作為添加物時(shí)，凍干后計(jì)算所得的細(xì)胞存活率最高，為59.66%。因此選擇含量為3%山梨醇為醇類的最適添加量。

2.2.2 氨基酸類的優(yōu)化

根據(jù)“玻璃態(tài)假說(shuō)”，高濃度氨基酸分子會(huì)發(fā)生兼顧固體和流體的狀態(tài)的玻璃化，黏度極高且難以形成結(jié)晶，還存在可形成氫鍵的功能團(tuán)，與菌體表面的自由基相互連結(jié)避免菌體暴露在介質(zhì)中[11]。本實(shí)驗(yàn)選取谷氨酸鈉以及L-半胱氨酸為氨基酸類添加物進(jìn)行凍干，以復(fù)水后細(xì)胞存活率為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 保護(hù)劑中氨基酸類的確定及L-半胱氨酸含量的確定

由圖2（a）可知，添加了谷氨酸鈉以及L-半胱氨酸的保護(hù)劑與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率均有所上升。添加了L-半胱氨酸的保護(hù)劑凍干后計(jì)算細(xì)胞存活率為55.43%，因此選用L-半胱氨酸作為保護(hù)劑中氨基酸類物質(zhì)。如圖2（b）所示，取0.1%、0.2%、0.3%含量的L-半胱氨酸進(jìn)行單因素試驗(yàn)，當(dāng)選取0.2%含量L-半胱氨酸作為添加物時(shí)，凍干后計(jì)算所得的細(xì)胞存活率最高，為56.19%。分析細(xì)胞存活率隨著L-半胱氨酸的增加先升高后降低的原因可能是氨基酸類與糖類相似，在濃度過(guò)高時(shí)玻璃化加劇，導(dǎo)致粘度過(guò)大、復(fù)水效果差。這與Fatemeh 等[12]研究?jī)龈傻葍?chǔ)存方法對(duì)鏈霉菌代謝的影響時(shí)結(jié)論一致。因此選擇0.2%L-半胱氨酸為鹽類的最適添加量以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 鹽類的優(yōu)化

鹽類在菌種凍干過(guò)程中一般用于調(diào)節(jié)體系滲透壓以及充當(dāng)緩沖溶液來(lái)中和細(xì)菌在凍干過(guò)程中的所產(chǎn)生的有機(jī)酸。本實(shí)驗(yàn)選取3 種鹽類保護(hù)劑添加物進(jìn)行凍干，以期復(fù)水后獲得最大細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3（a）可知，三種鹽類添加物乙酸鈉、硫酸錳、氯化鈣對(duì)于細(xì)胞在凍干過(guò)程中均有保護(hù)作用，其中添加乙酸鈉的保護(hù)劑細(xì)胞存活率最高，因此選取乙酸鈉作為鹽類的最佳添加物。如圖3（b）所示，以0.1%、0.2%、0.3%的乙酸鈉進(jìn)行單因素試驗(yàn)，當(dāng)選取0.2%乙酸鈉作為添加物時(shí)，凍干后計(jì)算所得的細(xì)胞存活率最高，為59.74%，因此選擇0.2%乙酸鈉為鹽類的最適添加量。

圖3 保護(hù)劑中鹽類的確定及乙酸鈉含量的測(cè)定

2.2.4 糖類的優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)具有黏度的糖類保護(hù)劑包圍在菌體周圍會(huì)阻止蛋白質(zhì)的伸展及沉淀以維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到保護(hù)菌體的目的[7]。因此本實(shí)驗(yàn)為了探究不同糖類對(duì)菌體的保護(hù)作用，添加含量為10%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖以及果糖為糖類添加物進(jìn)行保護(hù)劑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4（a）可知，添加乳糖、海藻糖的細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于對(duì)照組與其他幾種糖類，細(xì)胞存活率分別為73.40%及68.83%。這與王琳等[11]報(bào)道的在副干酪乳桿菌凍干過(guò)程中，篩選雙糖類保護(hù)劑時(shí)乳糖的效果最佳的結(jié)論一致。原因可能是由于乳糖不僅具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和穩(wěn)定的玻璃態(tài)性質(zhì)，還可以與脂雙層相互作用，對(duì)嗜熱鏈球菌grx90 在冷凍干燥過(guò)程中維持細(xì)胞膜上的脂質(zhì)體的物理結(jié)構(gòu)有積極意義。除此之外，乳糖作為保護(hù)劑添加物的工業(yè)成本遠(yuǎn)低于海藻糖，因此選取乳糖作為糖類添加物。由圖4（b）可知，5%、10%、15%三種不同濃度的乳糖作為保護(hù)劑添加物時(shí)，10%濃度的乳糖添加量效果最佳，凍干后細(xì)胞存活率為71.22%。這與Lee 等人[14]在探究保護(hù)劑和復(fù)水條件對(duì)凍干后的植物乳桿菌發(fā)酵能力的影響時(shí)結(jié)果一致。原因可能是由于10%的乳糖為grx90 提供了最合適的滲透壓環(huán)境，因此選擇濃度為10%的乳糖進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 保護(hù)劑中糖類的確定及乳糖含量的確定

2.2.5 正交優(yōu)化

單一保護(hù)劑并不能滿足食品工業(yè)對(duì)發(fā)酵劑的要求，因此在凍干過(guò)程中一般使用復(fù)配保護(hù)劑，而復(fù)配保護(hù)劑中的不同成分在在凍干過(guò)程中各自發(fā)揮著不同作用，但是卻又相互協(xié)同[15]。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化保護(hù)劑中不同成分的配比并測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)果如表4所示。

表4 嗜熱鏈球菌grx90保護(hù)劑正交優(yōu)化表

根據(jù)表4 可知，最優(yōu)培養(yǎng)基的配方為A3B1C3D1，即乳糖含量為5%、山梨醇含量為2%、L-半胱氨酸、乙酸鈉0.1%。由于得到的最優(yōu)組合在正交設(shè)計(jì)中沒(méi)有，故需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果為91.37%，優(yōu)于正交表中最高的第7組的值。

2.3 凍干條件的優(yōu)化

2.3.1 保護(hù)劑與菌體混合比例的優(yōu)化

菌懸液與凍干保護(hù)劑的混合比例也會(huì)影響凍干過(guò)程中的細(xì)胞存活率，當(dāng)總體積為2 ml 時(shí)選取5 種不同比例進(jìn)行凍干，復(fù)水后測(cè)定細(xì)胞細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 混合比例的確定

由圖5 可知，菌懸液與保護(hù)劑的比例過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)凍干時(shí)的細(xì)胞存活率產(chǎn)生不良影響。當(dāng)菌懸液與保護(hù)劑比例為1∶2 時(shí)得到最高的細(xì)胞存活率為92.01%。當(dāng)菌懸液與保護(hù)劑比例為3∶1 時(shí)，由于保護(hù)劑濃度過(guò)低，導(dǎo)致在凍干過(guò)程中，細(xì)菌損傷失活現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞存活率降低，僅為71.23%。但是加入過(guò)多的保護(hù)劑，則會(huì)降低菌粉的菌體含量，同時(shí)在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中也加大了生產(chǎn)成本，因此選取1∶2 作為最適混合比例。

2.3.2 裝液高度的優(yōu)化

圖6 裝液高度的確定

由圖6 所知，細(xì)胞存活率隨著裝液高度的增加先增加后減小，在7 mm 時(shí)達(dá)到最高，為93.49%，隨后開(kāi)始大幅降低，過(guò)薄或過(guò)厚的裝液高度不利于細(xì)胞的存活，當(dāng)裝液高度過(guò)厚時(shí)，細(xì)胞無(wú)法完全凍干，導(dǎo)致細(xì)胞存活率大大降低；而裝液高度過(guò)低時(shí)，保護(hù)劑在凍干過(guò)程中，脫水速率過(guò)快，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷影響存活率，因此選擇7 mm 為最適裝液高度。

2.3.3 預(yù)凍時(shí)間的優(yōu)化

圖7 預(yù)凍時(shí)間的確定

由圖7 可知，細(xì)胞存活率隨著預(yù)凍時(shí)間的增長(zhǎng)先上升后下降，在12 h 時(shí)達(dá)到峰值，為94.13%。推測(cè)原因可能是由于預(yù)凍時(shí)間過(guò)短，溫度下降速率過(guò)快而導(dǎo)致細(xì)胞脫水速率過(guò)快，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，使得細(xì)胞存活率過(guò)低。預(yù)凍過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞失去生長(zhǎng)活性，細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。因此應(yīng)選取12 h為最適預(yù)凍時(shí)間。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)為提升由江蘇省乳制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的專利菌株嗜熱鏈球菌grx90 在冷凍干燥過(guò)程中的細(xì)胞存活率，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)凍干過(guò)程之前的離心條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在離心條件為轉(zhuǎn)速8 000 r/min、時(shí)間8 min 時(shí)細(xì)胞存活率最高。其次，利用單因素篩選以及正交優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)確定了糖類、醇類、鹽類、氨基酸類在脫脂乳保護(hù)劑中的最佳添加物及含量分別為5%乳糖、2%山梨醇、0.3%L-半胱氨酸、0.1%乙酸鈉。最后探究了凍干條件的對(duì)菌體存活率的影響，結(jié)果表明菌液與保護(hù)劑1∶2 混合裝液高度為7 mm，預(yù)凍12 h 后對(duì)嗜熱鏈球菌grx90 具有顯著保護(hù)作用，細(xì)胞存活率最高。