固相萃取小柱-超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中氯霉素

馬曉年，梁志堅(jiān)，李怡

（昆明市疾病預(yù)防控制中心,昆明650228）

0 引 言

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2008 年1 月15 日，衛(wèi)生部發(fā)布的《中國(guó)居民膳食指南(2007)》介紹了新版《膳食寶塔》凸顯牛奶價(jià)值，牛奶是攝取營(yíng)養(yǎng)元素的催化劑以及健康的關(guān)鍵，是健康膳食的基石[1]。但由于奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)泌乳期奶牛用藥不當(dāng)、違反國(guó)家規(guī)定把抗生素作為奶牛飼料添加劑使用、未經(jīng)徹底清洗和消毒患病奶牛使用過(guò)的擠奶工具及貯奶設(shè)備、高溫季節(jié)摻雜抗生素防止牛奶酸敗等原因，造成牛奶抗生素污染[2-3]。牛奶中的抗生素殘留主要以氯霉素為主，氯霉素(Chloram?phnicol，CAP)屬?gòu)V譜抗生素，能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療，特別是用于奶牛乳腺炎的治療，從而易使奶及奶制品中存在氯霉素殘留。由于氯霉素可引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[4]，1999 年9 月13 日中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[5]的通知，規(guī)定了氯霉素在所有食品動(dòng)物的可食用組織不得檢出。

目前，氯霉素主要通過(guò)固相萃取小柱進(jìn)行前處理的提取、凈化[6-7]，測(cè)定方法有液相色譜[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9-15]。液相色譜采用保留時(shí)間定性，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜采用核質(zhì)比定性，具有更高的準(zhǔn)確度。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜較于液相色譜具有更高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量物質(zhì)更低的檢出限。前處理部分，國(guó)標(biāo)方法[11]采用C18 固相萃取小柱對(duì)牛奶進(jìn)行提取、凈化，風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)[12]采用MSC 固相萃取小柱提取、凈化雞蛋等高蛋白樣品。依據(jù)上述信息，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了C18、MSC 兩種固相萃取小柱對(duì)牛奶樣品中氯霉素的提取效果，為牛奶中氯霉素的測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500 質(zhì)譜分析儀（美國(guó)AB SCIEX）；Ag?ilent 1290 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器）；振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA）；氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）；電子天平（Sartorius,0.01 mg）；均質(zhì)器；Agela Technologies Cleanert MCS-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）；Agela Technologies Cleanert S C18-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。

液態(tài)牛奶，市購(gòu)；氯霉素（壇墨質(zhì)檢-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；氯霉素-D5（壇墨質(zhì)檢-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)JT Baker）；氨水、氯化鈉（分析純）；正己烷（優(yōu)級(jí)純）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到25.00 ng/mL 的氯霉素應(yīng)用液。準(zhǔn)確量取氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到20.00 ng/mL 的氯霉素-D5 應(yīng)用液。標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液均于4 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品的提取

取10 g（精確至0.01g）均質(zhì)好的牛奶樣品于50 mL離心管中，加氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液100 μL，再加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，5 000 r/min 離心10 min，取乙酸乙酯層于雞心瓶中。再加20 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL 4%氯化鈉溶液溶解殘留物，加5 mL 正己烷振蕩混合1 min，靜置分層，棄去正己烷。再加正己烷5 mL，重復(fù)提取一次，取下層液備用。

1.2.3 樣品的凈化

C18及MCS小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，取備用液分別過(guò)C18 及MCS 固相萃取小柱，用5 mL水淋洗抽干，再用5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?.0 mL甲醇溶解殘留物，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm 濾膜，供超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定。

1.2.4 儀器條件

色譜：Syncronis C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.05%氨水，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫程序件（見(jiàn)表1）；流速：0.40 mL/min，分析時(shí)間5 min，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫30 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

質(zhì)譜：離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負(fù)離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓：4.0 kV；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；離子源溫度：500 ℃；噴霧器壓力：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣壓力：35 psi；其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)待測(cè)物的性質(zhì)，使用氯霉素及氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液在ESI-模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。選擇每種藥物響應(yīng)強(qiáng)度最高的m/z 值作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓。并在MRM 模式下優(yōu)化了氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本文實(shí)驗(yàn)了Hypersll GOLD色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm），Syncronis C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm），發(fā)現(xiàn)采用Hypersll GOLD 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm）分離時(shí)，色譜峰展寬，響應(yīng)值偏低。采用Syncronis C18色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm）分離時(shí)，色譜峰得到較大改善，峰形收窄，響應(yīng)增高，基線噪音降低，實(shí)現(xiàn)更低檢出限。

本文選擇流動(dòng)相時(shí)考慮到是ESI-模式，所以使用了0.05%氨水及具有改善峰形作用的乙腈。低流速時(shí)，峰形展寬、拖尾，綜合分離效果及柱壓等因素，最終選擇0.4 mL/min 流速。圖1 為1.00 ng/mL 的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM 譜圖。

圖1 CPA標(biāo)準(zhǔn)MRM譜圖

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

本文試驗(yàn)了乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）、乙腈-乙酸乙酯（50：50）及乙酸乙酯的提取效果。乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）分層效果不理想，震搖乳化。乙腈-乙酸乙酯（50：50）提取，分層效果較好（分為乙腈層、磷脂層、乙酸乙酯層），但加標(biāo)回收率較低，在21.6%～48.5%之間。乙酸乙酯，振蕩提取效果較好，回收率均能達(dá)50%以上。

圖2 不同提取溶劑對(duì)比

2.3.2 提取方法的選擇

本文比較了《2019 年國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》[11]中用乙酸乙酯提取一次，氮?dú)獯蹈伤芙膺^(guò)固相萃取小柱提取、凈化，及GB 29688-2013《牛奶中氯霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[12]中乙酸乙酯提取兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，水溶液溶解過(guò)固相萃取小柱提取、凈化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，手冊(cè)的提取方法損失較大，回收率均于60%以下，國(guó)標(biāo)方法提取效果較佳。

2.3.3 固相萃取柱的選擇

本文進(jìn)行了0.10、0.50、2.50、10.00 ng 4 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，比較了C18 及MCS 兩種固相萃取小柱對(duì)氯霉素的保留能力。結(jié)果表明MCS 固相萃取小柱4 個(gè)水平的回收均實(shí)現(xiàn)75%以上，而C18 固相萃取小柱在低水平回收實(shí)驗(yàn)中效果不佳，回收率低于50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種固相萃取柱的回收率（%）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用甲醇將氯霉素-D5 及氯霉素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液制備成含氯霉素-D5 2.00 ng/mL，含氯霉素分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在確定的分析條件下進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，氯霉素與氯霉素-D5 響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表4。

表4 氯霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.5 精密度及準(zhǔn)確度

圖3 工作曲線

取不含氯霉素的牛奶樣品分別過(guò)C18 及MCS 固相萃取小柱進(jìn)行三水平加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表中可見(jiàn)，C18 固相萃取小柱回收率在31.4%～155%之間，在低水平及高水平的回收率均不理想，而MCS 固相萃取小柱在三個(gè)水平的加標(biāo)回收率均能達(dá)到50.4%以上。結(jié)合上述固相萃取小柱回收試驗(yàn)，說(shuō)明MCS 固相萃取小柱有更良好的準(zhǔn)確性，適宜于牛奶中氯霉素殘留的痕量測(cè)定。圖4 為牛奶樣品添加氯霉素的MRM 譜圖。

表5 氯霉素在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

圖4 加標(biāo)樣品MRM譜圖

3 結(jié) 論

本研究采用2 種不同的固相萃取小柱對(duì)牛奶中的氯霉素進(jìn)行提取、富集和凈化，通過(guò)對(duì)回收率、精密度、定量限等指標(biāo)進(jìn)行考察，得出MCS 固相萃取小柱損失小，回收率高，同時(shí)檢出限可達(dá)到0.004 μg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法，且穩(wěn)定性高，適用于大量樣品的集中測(cè)定。

建立了UPLC-MS/MS 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定牛奶中氯霉素含量的方法。分析過(guò)程中引入氯霉素-D5 作為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)于分析全過(guò)程中導(dǎo)致目標(biāo)物損失給予完全的校正，改善了方法的精密度。以Syncronis C18 色譜柱分離，流動(dòng)相為0.05%氨水和乙腈，電噴霧負(fù)離子MRM 模式檢測(cè)。該法測(cè)定周期短、定性、定量準(zhǔn)確，適用于痕量氯霉素的檢測(cè)。