水酶法提取百香果籽油工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究※

劉松奇 戢得蓉 段麗麗

(四川旅游學院，四川 成都 610100)

百香果，又名西番蓮，原產于熱帶非洲，其果籽含有豐富的油脂及其他功能性成分。已有對百香果種籽中總黃酮的體內抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)其抗氧化性效果顯著，百香果籽油可以作為開發(fā)保健型食品的備選材料。利用百香果籽含油量高的特點，選擇合適的方式提取其油脂，是目前對百香果籽研究的一大熱點。

目前常見的從種籽中提取油脂的方法有傳統(tǒng)壓榨法、索氏提取法、超聲波(微波)輔助提取法[1-2]、水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳提取法[3]、冷壓法結合固相微萃取分離法等[4]。比較壓榨法、浸出法、超臨界法、水代法及水酶法提取茶油發(fā)現(xiàn)水酶法及水代法提取的油脂品質均優(yōu)于其他方法[5]。與溶劑法、壓榨法相比，水酶法不會改變油脂的脂肪酸組成，毛油質量更有利于后續(xù)精煉工藝的指標特征，與水劑法相比，水酶法可以提高油脂VE的含量與氧化穩(wěn)定性[6]。水酶法相對于其他方法，具有安全、綠色、高效的特點，同時具有條件溫和、能耗較低、污染少、廢物易處理等優(yōu)點，所提取的油脂品質也較高。

本研究采用水酶法提取百香果籽油，利用混料實驗設計優(yōu)化復合酶的配比、響應面實驗優(yōu)化提取工藝、DPPH法初步評價此方法所提百香果籽油的抗氧化性。將百香果籽油脂進行提取，既豐富了百香果籽的應用，又豐富了油脂的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

百香果紫果：湖南邵陽市；山核桃油：遼寧晟麥實業(yè)股份有限公司；橄欖油：哈爾濱普潤油脂有限公司；酸性蛋白酶、糖化酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶及葡聚糖酶：河南慶飛食品配料有限公司；氫氧化鉀、異丙醇、無水乙醚、無水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、酚酞、堿藍6B、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、正己烷、鹽酸分析純、DPPH：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

Scout SE型電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；DFY-400搖擺式粉碎機：溫嶺市大德藥機有限公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；101-0A型電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；STARTER 3100型pH計：奧豪斯儀器(上海)有限公司；UV BlueStar A紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝

將干燥的百香果籽于105℃烘干至恒重，后用高速粉碎機進行破壁粉碎并混合均勻，稱量10g粉碎后的百香果籽，加入一定量的水，混合均勻后調節(jié)pH，添加酶后搖勻，酶解一段時間后，將酶解容器置于90℃滅酶20min，然后冷卻至室溫后置于-18℃凍藏20h，凍藏結束后置于40℃解凍2h，解凍后離心(9000r/min,20min)后吸取上層清油，低溫烘干至質量恒定，計算百香果籽油提油率。

1.2.2 提油率的計算

百香果籽油提取率：

w(%)=[m2/(m1×B)]×100%

(1)

式(1)中：B為百香果籽的總脂肪量/%，m1為稱取粉碎后百香果籽總質量/g，m2為提取得到百香果籽油的質量/g。

1.2.3 酶種類的篩選

百香果籽細胞壁主要是粗纖維構成，而水酶法主要是通過酶破壞油脂與蛋白質(糖類)結合形成的復合物來達到釋放油脂，提高提油率的目的。考察8種酶(最適pH值，最適溫度/℃)：果膠酶(3.5，50℃)，糖化酶(4.0～4.5，60℃～62℃)，酸性蛋白酶(3.0，40℃)，中性蛋白酶(6.9，48℃)，堿性蛋白酶(8.0，50℃)，纖維素酶(4.8，50℃)，木瓜蛋白酶(6.5，60℃)及葡聚糖酶(4.2，60℃)對百香果籽油提油率的影響。分別在所選8種酶的最適pH值、最適宜溫度條件下，以相同的料液比(1∶3)、酶用量(2%)酶解相同的時間(6h)進行提取，計算不同酶酶解后的百香果籽油的提取率。

1.2.4 單因素實驗

其他條件相同的前提下，分別探討pH值(4.5、5、5.5、6、6.5)，酶解溫度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)，酶制劑用量(1%、2%、3%、4%、5%)，酶解時間(3h、4h、5h、6h、7h)，料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)5個因素對提油率的影響。

1.2.5 混料實驗優(yōu)化分析

采用Design Expert10.0.4設計混料實驗，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)為自變量，百香果籽油提油率為響應值，并把3種酶的添加比均限定在(0.1～0.8)且A+B+C=1(100%)。

1.2.6 響應面優(yōu)化分析

根據Box-Behnken實驗設計原理，以百香果籽提油率為響應值，選取酶制劑用量、酶解溫度、pH值這三個因素進行響應面優(yōu)化實驗[7]。響應面實驗因素與水平表見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.2.7 理化指標測定

粗脂肪測定參考NY/T 4-1982《谷類、油料作物種子粗脂肪測定》；酸價測定參考GB 5009.229-2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》；過氧化值測定參考GB 5009.227-2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》；皂化值參考GB/T 5534-2008《動植物油脂 皂化值的測定》；油脂質量評價參考GB 2716-2018《食品安全國家標準 植物油》。

紫外測定：將百香果籽油配制成1g/100ml正己烷溶液，于270nm～900nm波長處測其紫外吸收光譜。

1.2.8 DPPH自由基清除率的測定

用無水乙醇配制0.10mmol/L DPPH溶液，用乙酸乙酯配制不同濃度的樣品液(5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL),在比色皿中分別加入試劑與樣品液，混勻后于517nm波長測定吸光度，計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率：

S(%)=[C-(A-B)]/C

(2)

式(2)中：A為2mL DPPH溶液+2mL樣品液，B為2mL無水乙醇+2mL樣品液，C為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶劑。

1.3 實驗數(shù)據與處理

所有實驗平行三次及以上，數(shù)據采用Excel進行處理。

2 結果與分析

2.1 酶的種類對提油率的影響

選取8種酶進行實驗，所得結果如圖1，提油率最好的3種酶制劑是堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及木瓜蛋白酶。但是堿性蛋白酶與酸性蛋白酶分別在偏強堿和偏強酸條件才能體現(xiàn)其活力，而油脂在強酸和強堿條件下遇較高溫度會較快水解，不利于油脂的穩(wěn)定性[8]。結合實驗結果及酶的專一性，使用復合酶提取油脂，總提取率會稍高，同時為節(jié)約成本，選取pH以及酶解溫度相近的酶進行復配，利用混合酶提高提油率，所以將木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶進行復配，初步采用添加比例為1∶1∶1。

圖1 不同酶作用下百香果籽油的提油率

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 pH對提油率的影響

在60℃酶解溫度、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為3.5%、料液比為1∶3條件下酶解6h，研究不同pH條件對提油率的影響，結果如圖2。pH對百香果籽油的提取有顯著影響，提油率隨著酶解pH的升高先增加后減小，在pH為5.5時達到38%。這可能與復合酶的最適酶解pH值有關，pH的改變影響酶分子活性部位上有關基團的解離，從而降低酶與原料的結合力，降低油脂的釋放。

圖2 不同pH作用下百香果籽油的提油率

2.2.2 溫度對提油率的影響

在相同的pH值為5.5、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為3.5%、料液比為1∶3條件下酶解6h，考察溫度的改變對提油率的影響，結果如圖3。溫度由45℃升到55℃時，提油率迅速上升，在55℃提油率達到最高。溫度上升提油率下降是由于一般情況下環(huán)境溫度每升高10℃，酶解速度就增快一倍左右[9]，直到酶解速度達到相對最大值，后期溫度繼續(xù)升高，蛋白質逐漸發(fā)生變性，導致酶失去活性，提油率逐漸降低。

圖3 不同溫度作用下百香果籽油的提油率

2.2.3 酶制劑用量對提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、料液比為1∶3條件下酶解6h，考察酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量對提油率的影響，結果如圖4。酶制劑添加量從1%增加到4%的這個過程中，提油率逐步提高。但是超過4%之后，提油率開始出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這可能是因為酶的競爭性抑制作用降低酶解的效率。

圖4 不同酶制劑用量百香果籽油的提油率

2.2.4 料液比用量對提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為4%條件下酶解6h，考察料液比對提油率的影響，結果如圖5。當料液比在從1∶2到1∶3，提油率迅速提高，可能是因為隨著水分的增加，增大了酶與底物的擴散，使兩者充分接觸，然而1∶3之后提油率開始下降，可能因為大量水分降低了酶與底物的濃度，使兩者的碰撞率下降，從而降低提油率。

2.2.5 酶解時間對提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、料液比為1∶3、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為4%條件下考察酶解時間對提油率的影響，結果如圖6所示。隨著反應時間的增加提油率也逐漸增加，反應時間達到6h時得到最大提油率，隨后漸漸穩(wěn)定，由此可推測時間的增加，底物濃度逐漸減少，當達到6h時酶解基本結束，考慮到能源消耗問題選擇6h為宜。

圖6 不同酶解時間下百香果籽油的提油率

2.3 酶解法提取百香果籽油的混料實驗結果

在單因素實驗結果下，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)為特征值，提油率為響應值，進行混料實驗，結果如表2。

表2 混料實驗結果

利用Design Expert 10.0.4軟件，對表2中的數(shù)據進行回歸擬合，得到提油率與葡聚糖酶(A)、木瓜蛋白酶(B)、糖化酶(C)的多元線性回歸方程：提油率=+31.49A+40.78B+35.74C-37.28AB-7.32AC+4.1BC-28.6ABC+116.75AB(A-B)-66.7AC(A-C)+0BC(B-C)。對以上回歸模型進行方差分析，詳見表3。

回歸方程中由F分布來檢驗響應面的顯著性，概率P值越小，對應自變量顯著性越好。由表3得出，提油率模型總回歸項為顯著(P=0.016 5<0.05)，失擬性不顯著(P=0.424 0>0.05)說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，即該回歸模型擬合度好，實驗誤差比較小。校正決定系數(shù)Adj.R2是0.816 0，表示模型擬合較好。CV值是6.59%，說明該回歸模型的數(shù)據精確度較高。性噪比AP為7.912大于4，說明模型的可行度比較高。決定系數(shù)R2為0.929 2，說明二次項模型中估測值與實驗真實值之間的相關性可達92.92%。

表3 混料實驗方差分析結果

注：P<0.05表示差異顯著，標注為*；P<0.01表示差異極顯著標注為**。

復合酶的配比對提油率交互影響的三維圖、等高線圖形如圖7。當葡聚糖酶用量較多，木瓜蛋白酶與糖化酶用量較少時，提油率在30%左右。而當木瓜蛋白酶或糖化酶用量較多，另外兩種酶用量較少時，提油率均能達到40%。3種酶在酶解過程中，木瓜蛋白酶與糖化酶均能起到主導作用，同時三維圖的曲面說明酶與酶之間有交互作用，3種酶適宜的配比混合后產生協(xié)同作用顯著提高提油率。最佳配比為木瓜蛋白酶∶葡聚糖酶∶糖化酶=0.8∶0.1∶0.1。

2.4 酶解法提取百香果籽油的響應面實驗結果

以pH(A)、溫度(B)、酶制劑用量(C)等影響因素為特征值，響應值為提油率，進行三因素三水平的響應面分析，實驗結果如表4。

表4 響應面實驗結果

利用Design Expert 10.0.4軟件，對表4中的數(shù)據進行回歸擬合，得到提油率與酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶制劑用量(C)的多元線性回歸方程：提油率=+48.90+6.00A+3.13B-1.50C-6.63AB+8.88AC-3.88BC-2.89A2-2.14B2-5.89C2。對以上回歸模型進行方差分析，詳見表5。

表5 響應面實驗方差分析結果

注：P<0.05表示差異顯著，標注為*；P<0.01表示差異極顯著標注為**。

由表5可知，校正決定系數(shù)Adj.R2是0.880 8，預測復相關系數(shù)Pred.R2為0.761 3說明模型擬合較好。性噪比AP為12.884大于4，說明模型的可行度比較高。決定系數(shù)R2為0.947 8，說明二次項模型中估測值與實驗真實值之間的相關性可達94.78%。

各因素交互作用對百香果籽油提油率的影響見圖8，酶用量與溫度的交互作用對百香果籽油的提油率影響顯著，酶解溫度與pH值、酶制劑用量與pH值的交互作用對百香果籽油的提油率影響極顯著。酶解溫度在50℃、酶制劑用量為4.96%、pH=6時提油率最高，可達58.75%。在最優(yōu)條件下，進行平行三次實驗。結果分別為57.00%、56.96%、59.02%，提油率平均分值與預測值相對偏差小于5%，測定結果穩(wěn)定，實驗結果可靠，說明回歸方程具有較高的準確性。

圖8 各因素交互作用對百香果籽油提油率的影響

2.5 DPPH自由基清除率實驗結果

圖9 油脂的DPPH自由基清除率

百香果籽油對DPPH自由基清除率結果見圖9，百香果籽油在實驗范圍內對DPPH自由基有一定的清除作用，清除能力隨著油脂濃度的增加而增強，最大清除率可達到78.6%。與橄欖油及山核桃油這兩種優(yōu)質食用油相比，結果表明清除能力相近，體外抗氧化活性較強。整體可以看出水酶法提取的百香果籽油的DPPH自由基清除率效果較好。

2.6 理化指標測定

對所選品種的百香果籽進行油脂含量實驗，其粗脂肪含量為20%。通過最佳工藝條件，所提取的油脂呈淡黃色，透明度好，無異味略帶百香果芳香味。百香果籽油酸價不大于4.0mg KOH/g，過氧化值不大于0.25g/100g，由表6可知，水酶法提取的百香果籽油均符合國家標準。對水酶法所提取的百香果籽油在270nm～350nm范圍內紫外吸收較強，表明其有一定的防護作用，百香果香氣成分豐富，其油也有一定的香味，可用于化妝品中的防曬產品與香水產品。

表6 百香果籽油理化指標結果

3 結論

為了提高百香果籽油的提油率，對單一酶及復合酶的種類進行了篩選，確定了木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶為研究對象的提取工藝。經混料實驗優(yōu)化后，確定木瓜蛋白酶、葡聚糖酶與糖化酶的最佳配比為8∶1∶1。通過單因素實驗得出，酶解溫度為50℃～60℃、酶制劑用量為3%～5%、pH值為5～6，作為響應面實驗范圍。通過響應面實驗確定提取百香果籽油的最佳工藝為：酶解溫度為50℃、酶制劑用量為4.96%、pH值為6、時間6h、料液比1∶3。在此條件下提油率可達58.75%，提取的百香果籽油色澤良好、透明度好、氣味芬芳無異味。對百香果籽油的紫外測定發(fā)現(xiàn)其在270nm～350nm紫外吸收較強，水酶法方式提取的百香果籽油DPPH清除能力較好。