一種血樣中卡托普利的電化學(xué)分析方法研究

胡甲元，陸浩天,翟佳莉，葛靜如，解永巖

（1.合肥樂凱科技產(chǎn)業(yè)有限公司，安徽 合肥230041；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥230032；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012）

卡托普利（Captopril）結(jié)構(gòu)式如圖1A，它是一種口服可吸收且能有效控制血壓的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑[1]，已經(jīng)成為醫(yī)治高血壓[2]、心力衰竭[3]、慢性心功能不全[4-5]等心血管疾病的重要藥物，但長期或過量使用可能導(dǎo)致經(jīng)常性干咳、蛋白尿，甚至膽汁淤積等副作用[6-9]，因此對血液系統(tǒng)（如血清、血漿甚至全血）中卡托普利的定量分析非常重要。目前已報(bào)道的卡托普利的分析方法如毛細(xì)管電泳法[10]、高效液相色譜法[11-12]、化學(xué)發(fā)光法[13]等存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜耗時(shí)、分析時(shí)間長、需要對樣品進(jìn)行衍生等不足。電化學(xué)方法具有儀器設(shè)備簡單、響應(yīng)迅速、選擇性和靈敏度可控等優(yōu)勢[14]，因此建立簡單快速的卡托普利的電化學(xué)分析方法對于指導(dǎo)其臨床安全用藥，了解其臨床上的藥效關(guān)系等是十分必要的。

8-羥基-1,3,6-三磺酸芘（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt,HPTS）（圖1B）是一種有機(jī)光酸，具有較快的電極過程動力學(xué)以及可逆的電化學(xué)氧化還原行為，但目前還沒有使用HPTS 作為電化學(xué)催化劑或者氧化還原電子媒介體對分析物進(jìn)行電化學(xué)分析的報(bào)道。

本研究首次采用HPTS 作為卡托普利的電化學(xué)氧化的催化劑，建立了一種簡單有效的卡托普利的電化學(xué)分析方法。本方法具有操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，并成功應(yīng)用于血漿樣品中卡托普利的分析檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

圖1 卡托普利（A）和HPTS（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

卡托普利，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；8-羥基-1,3,6-三酸芘（HPTS），阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；Britton-Robinson buffer（B-R buffer）緩沖液由40 mM 磷酸、40 mM 醋酸和40 mM 硼酸組成，用0.2 M NaOH調(diào)至不同pH；0.1 M 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-buffered solution，PBS）用磷酸配制調(diào)至pH為7.4；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI730E 電化學(xué)工作站（上海辰華有限公司）；EX125DZH 十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司，常州）；PHS-3C型pH計(jì)（世紀(jì)方舟科技有限公司，成都）；超聲清洗儀；79-1 磁力攪拌器（國宇儀器制造有限公司，常州）。

1.3 電化學(xué)測試

實(shí)驗(yàn)采用三電極體系，拋光過后的裸玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl（內(nèi)參為飽和氯化鉀）作為參比電極，鉑絲作為對電極。玻碳電極（Φ=3 mm）作為工作電極。使用前首先分別經(jīng)粒徑為3.0 μm、1.0 μm、0.05 μm的Al2O3粉末拋光，然后再置于無水乙醇和水中各超聲清洗3 min，N2吹干備用。實(shí)驗(yàn)中采用循環(huán)伏安（CV）技術(shù)和線性掃描（LSV）技術(shù)，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。比較不同pH 條件下HPTS 對卡托普利的電化學(xué)催化性能時(shí)，為避免不同pH 條件下相同濃度HPTS 自身的氧化電流的不同，數(shù)據(jù)處理采用歸一化處理，即用催化電流比值（ΔI/I）來衡量不同pH 條件下的催化效果。其中ΔI/I=IHPTS+captopril-IHPTS/IHPTS。

1.4 動物手術(shù)實(shí)驗(yàn)動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠3 只（200～250 g），購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。動物分養(yǎng)于室溫和自然光照周期環(huán)境中，并自由飲水和取食。實(shí)驗(yàn)符合安徽中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的“實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南”。用3%戊巴比妥鈉（1.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，從大鼠腹主動脈收集血漿，轉(zhuǎn)移到含有肝素抗凝劑的離心管中，3 000 r/min進(jìn)行離心，離心15 min，取上清液得到血漿。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即麻醉后斷頭處死大鼠，動物尸體由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物房回收。

1.5 實(shí)際樣品測試

配制500 μM的HPTS 2 mL(pH為7.4)于燒杯中，分別加入40 μL 的空白血漿（稀釋50 倍）和10 μL 2 mM、10 μL 10 mM、10 μL 100 mM 的卡托普利溶液進(jìn)行實(shí)際樣品測試，重復(fù)三次。采用線性掃描技術(shù)（LSV）測定樣品溶液，掃描電位0.32～0.68 V，掃速為50 mVs-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于HPTS卡托普利的電化學(xué)催化氧化行為研究

圖2 500 μM 卡托普利（黑線）、500 μM HPTS（紅線）和500 μM 卡托普利500 μM HPTS混合物（藍(lán)線）在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖（掃描速度：50 mV×s-1）

卡托普利的巰基氧化為二硫鍵的電化學(xué)氧化，具有較大的過電位以及較慢的電極動力學(xué)過程，如圖2中黑線所示，單獨(dú)的卡托普利在玻碳電極上從+0.6 V（vs.Ag/AgCl）開始緩慢氧化。HPTS 在pH 7.4 條件下，E1/2為+0.51 V處出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰，對應(yīng)于HPTS的酚羥基和HPTS 醌自由基的一電子過程[15]。當(dāng)往HPTS 溶液中加入卡托普利后，可以看到相較于相同濃度單獨(dú)的HPTS，二者混合物的氧化電流顯著增加（圖2，藍(lán)線），表明HPTS 對卡托普利的電化學(xué)氧化具有明顯的催化行為，這為利用HPTS 作為電化學(xué)催化劑來建立卡托普利的電化學(xué)分析方法提供了先決條件。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 卡托普利的電化學(xué)催化氧化對pH的依賴性考查

以上結(jié)果表明，HPTS 可以作為卡托普利電化學(xué)氧化有效的電化學(xué)催化劑，可以據(jù)此建立基于HPTS 的卡托普利的電化學(xué)分析方法。由于HPTS 的電化學(xué)氧化過程是pH依賴的，因此，我們用CV技術(shù)考查了不同pH條件下，HPTS對卡托普利的電化學(xué)氧化的催化性能，如圖3 所示，溶液pH 從5.0 增大到7.4，HPTS 的E1/2不斷負(fù)移，隨后不再移動。HPTS 氧化電流增加比率(ΔI/I)，隨著pH 增大不斷增加，在pH 為7.4 時(shí)，(ΔI/I)達(dá)到最大值，而后隨著pH 的增大ΔI/I 降低，表明HPTS 在生理?xiàng)l件下（pH 為7.4）對卡托普利的電化學(xué)氧化具有最大的催化效果，因此本研究選擇pH為7.4作為卡托普利的電化學(xué)分析的最優(yōu)化pH。

2.2.2 卡托普利的電化學(xué)催化氧化對HPTS 濃度依賴性的考查

圖3 單獨(dú)的500 μM HPTS（虛線）、500 μM 卡托普利和500 μM HPTS混合物（實(shí)線）在不同p H條件下的循環(huán)伏安曲線（掃描速度：50 mV×s-1，插入圖：催化電流比率（ΔI/I）和溶液pH的關(guān)系曲線）

電化學(xué)催化劑的濃度大小會直接影響到分析方法的分析性能。我們考查了在最優(yōu)化pH為7.4下，濃度為200 μM、500 μM、1 mM、2 mM 的HPTS 對不同濃度的卡托普利的電化學(xué)催化氧化的影響，結(jié)果如圖4 所示。在200 μM HPTS 的條件下，卡托普利的電流響應(yīng)不成線性，這可能是由于較低濃度的HPTS 對卡托普利的電化學(xué)催化效果不明顯所致。500 mM 的HPTS 的催化電流響應(yīng)在1～1 000 μM卡托普利的濃度范圍成良好的線性關(guān)系（I（μA）=0.002 7 C（μM）+1.35，相關(guān)系數(shù)為0.99）。隨著HPTS濃度的增加，靈敏度逐漸降低?；? mM HPTS和2 mM HPTS的卡托普利的分析方法靈敏度分別為0.002 5 mA/mM和0.002 3 mA/mM。較高濃度的HTPS 導(dǎo)致方法靈敏度下降，主要是由于高濃度的HPTS 具有較大的氧化背景電流。因此本研究選擇500 μM HPTS作為分析卡托普利的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 線性考查

圖4 在p H 為7.4條件下，200 μM、500 μM，1 mM、2 mM 的HPTS分別對1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、200 μM、500 μM、800 μM和1 000 μM的卡托普利的電化學(xué)氧化的峰電流與其相應(yīng)的濃度之間的線性關(guān)系

鑒于上述方法對卡托普利良好的電催化性能，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，用線性掃描技術(shù)（LSV）對卡托普利電化學(xué)分析進(jìn)行了方法學(xué)考查，如圖5所示。在1～1 000 μM的濃度范圍，氧化電流與卡托普利濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為I（μA）=0.002 7 C（μM）+1.35，相關(guān)系數(shù)為0.99，根據(jù)3 σ，計(jì)算檢測限為0.42 μM。

2.4 實(shí)際樣品測定

為了評估本方法對實(shí)際樣品中卡托普利定量分析的有效性，我們用稀釋了50 倍的大鼠血漿對本方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果表明，在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，空白血漿在本研究建立的基于HPTS 的電化學(xué)分析體系中的氧化峰電流響應(yīng)（紅線）與緩沖溶液中獲得的氧化峰電流(藍(lán)線)相同，這表明基于HPTS 的卡托普利的電化學(xué)方法具有較好的選擇性，方法不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)電活性物種的干擾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法用于實(shí)際血漿中卡托普利定量分析的可行性，對血漿樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。相較于緩沖溶液（藍(lán)線）和空白血漿溶液（紅線），加入了10 μM、50 μM 和500 μM卡托普利的血漿，氧化峰電流明顯增加。其加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，加標(biāo)回收率為98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。結(jié)果表明，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度，可以用作卡托普利藥物相關(guān)的常規(guī)檢測及臨床分析。

圖5 濃度為1～1 000 μM的卡托普利和500 μM HPTS混合溶液的線性掃描伏安圖（插入圖：500 μM HPTS對1～1 000 μM的卡托普利的電化學(xué)氧化峰電流與卡托普利濃度之間的線性關(guān)系）

圖6 含500 μM HPTS的0.1 M PBS(7.4)溶液（藍(lán)線）、含有50 μM被稀釋空白血漿和500 μM HPTS的0.1 M PBS(7.4)溶液（紅線）以及在紅線溶液中加入10 mM、50 mM、500 mM卡托普利的線性掃描伏安圖

3 結(jié)論

表1 空白血漿的加標(biāo)回收試驗(yàn)

本研究首次利用HPTS 作為卡托普利電化學(xué)氧化的電化學(xué)催化劑，建立了一種簡單快速、靈敏可靠、選擇性好的卡托普利電化學(xué)分析方法。結(jié)果表明，該方法具有操作簡單、響應(yīng)時(shí)間快、選擇性好的特點(diǎn)和優(yōu)勢，可有效用于實(shí)際血樣中卡托普利的定量分析。本研究為卡托普利的臨床安全用藥以及理解其藥效關(guān)系提供了有效的手段和方法。