中藥牛蒡子主要活性成分微生物轉(zhuǎn)化研究進展

尤文雅，張亞昆，趙逍遙，王秀伶

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

菊科草本植物牛蒡（Arctium lappaL.）具有藥食同源性。牛蒡根常作菜用或制作牛蒡茶，具有清熱解毒、利尿通便等功效[1]；牛蒡子是牛蒡的干燥成熟果實，具有疏風(fēng)散熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[2]。牛蒡子為我國傳統(tǒng)中藥，目前報道的牛蒡子的主要生物學(xué)活性包括抗炎[3]、抗癌[4]、抗糖尿病[2]、降血脂[5]、抑菌[6]、抗病毒[7]、止咳[8]、治療便秘[9]、免疫活性[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]、抗腎病[13]、抗老年癡呆[14]、抗過敏[15]、護肝[16]、抑制K+攣縮[17]等。臨床上，牛蒡子復(fù)方制劑可治療咽炎等上呼吸道炎癥、咳嗽和哮喘等肺部不適以及流感病毒引起的多種疾病。

1 牛蒡子主要活性成分

陳思有等[18]研究顯示，牛蒡子含有木脂素類、揮發(fā)油和油脂類成分，其中木脂素類化合物牛蒡苷（arctiin）和牛蒡苷元（arctigenin）是牛蒡子的主要有效成分。此外，馬天宇等[2]研究顯示，牛蒡子中還含有少量的生物堿、維生素、氨基酸及蛋白質(zhì)等。目前已知，牛蒡苷是中藥牛蒡子的標志性成分，牛蒡苷的含量為5.3% ～ 7.3%，平均為6.7%；牛蒡苷元的含量為0.5% ～ 1.5%，平均為0.55%[19]。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，牛蒡子中牛蒡苷含量不得低于5%。然而，不同產(chǎn)地牛蒡子中的牛蒡苷含量相差較大（見表1）。

從目前已有文獻來看，高效液相色譜法是牛蒡苷及牛蒡苷元最主要的檢測方法。米靖宇等[27]對產(chǎn)自黑龍江（哈爾濱）、遼寧（沈陽）、河南（鄭州）、山東（青島）、江蘇（南京、蘇州）、北京、天津、內(nèi)蒙古（呼和浩特）、四川（成都）、云南（昆明）、新疆（石河子）、青海（克拉瑪依）等地的牛蒡子中的牛蒡苷進行含量測定，結(jié)果顯示，牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量以產(chǎn)地昆明最高（8.02%），產(chǎn)地鄭州的最低（4.07%），其余產(chǎn)地牛蒡苷含量均介于5.47% ～ 7.07%之間。邵晶等[28]對吉林、四川（康定）、河南、甘肅（定西、臨洮、平?jīng)?、和政、慶陽、甘南）等地的牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量進行測定，結(jié)果顯示，除平?jīng)雠］蜃又械呐］蜍蘸枯^低外（3.96%），其余產(chǎn)地牛蒡苷含量在5.86% ～ 7.95%之間。王勁[25]對黑龍江（哈爾濱）、長春、遼寧（燈塔、葫蘆島）、山東（青島）、廣東（廣州）、四川（成都、阿壩、簡陽）、貴州和新疆等地的牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量進行測定，結(jié)果顯示，這些產(chǎn)地的樣品中牛蒡苷含量均在8%以上。另外，陳思有等[18]對黑龍江（五常）、吉林（梅河口、遼源、通化、延吉）、遼寧（岫巖、寬甸）、內(nèi)蒙古（山民）、重慶、陜西（太白）、甘肅（會川）等不同產(chǎn)地牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡苷元進行含量測定，結(jié)果顯示，所有樣品中牛蒡苷含量均在13%以上。根據(jù)楊亮蕊等[31]對云南昭通錦屏村、次山鄉(xiāng)、昭陽區(qū)、大理銀橋等4個地區(qū)牛蒡子樣品中牛蒡苷和牛蒡苷元的測定顯示，牛蒡苷的含量極低（0.069 1% ～ 0.153 5%）。目前，有關(guān)影響牛蒡子中牛蒡苷含量的因素尚不清楚。

表1 不同產(chǎn)地牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量比較Table 1 Comparison of arctiin and arctigenin contents in Arctii Fructus from different places

2 牛蒡苷和牛蒡苷元藥代動力學(xué)研究

呂佳[35]對牛蒡苷元在小鼠胃腸道吸收動力學(xué)、家兔體內(nèi)的血漿藥物動力學(xué)以及大鼠臟器分布狀況等進行了研究。其中，小鼠胃腸道吸收實驗結(jié)果顯示，牛蒡苷元在胃腸道內(nèi)較為穩(wěn)定；另外，家兔靜脈注射的牛蒡苷元濃度不同，牛蒡苷元在體內(nèi)的消除動力學(xué)也各不相同，靜脈注射低濃度（610 mg · kg-1）時，牛蒡苷元的消除符合線性動力學(xué)模型，而靜脈注射濃度較高時，牛蒡苷元在家兔體內(nèi)消除較快；給大鼠灌胃牛蒡苷元24 h 后檢測發(fā)現(xiàn)，約0.423%的牛蒡苷元從大鼠尿液中排出，0.11%從糞中排出；組織分布實驗結(jié)果顯示，牛蒡苷元廣泛分布在肝、肺、心、脾、腎等組織中，其中在肝、肺中的含量較高，但在腦組織中未檢測到牛蒡苷元。鄭一敏等[36]用300 mg · kg-1牛蒡苷灌胃大鼠后發(fā)現(xiàn)，其藥物動力學(xué)行為符合二室模型，血漿內(nèi)檢測到牛蒡苷是在經(jīng)口給藥5 min 后，消除現(xiàn)象發(fā)生在30 min 后；牛蒡苷在大鼠肝臟中分布最多，并在心、腎及腦部組織均有分布。類似地，胥秀英等[37]研究結(jié)果顯示，給小鼠灌胃牛蒡子后，牛蒡苷在不同組織分布濃度由高到低順序為肝、腎、心、腦。韓舒等[38]研究顯示，給大鼠皮下注射牛蒡苷元（0.3 mg · kg-1）后，在腸、心、肝、胰、腎等組織中均檢測到原形藥物。何斌等[39]對牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示，牛蒡苷元靜脈注射后血藥濃度與時間符合無吸收二室模型，這不同于呂佳[35]報道的家兔靜注牛蒡苷元后其藥代動力學(xué)行為屬無吸收單室模型。袁媛[40]對牛蒡子水提物的藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示，給大鼠灌胃牛蒡子水提物后，在大鼠的尿液和糞便中均檢測到了不同于牛蒡苷元的其他成分。此外，竇德強[41]研究結(jié)果顯示，胃腸道是牛蒡苷的主要代謝器官，而肝沒有參與代謝。

3 牛蒡苷和牛蒡苷元微生物轉(zhuǎn)化研究

3.1 哺乳動物糞樣菌群對牛蒡苷的轉(zhuǎn)化

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，被哺乳動物攝入體內(nèi)的牛蒡苷（1）可被脫糖轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元（2），這是牛蒡苷在機體內(nèi)發(fā)生的第一步代謝反應(yīng)。Nose 等[42]將底物牛蒡苷與小鼠糞樣菌群共培養(yǎng)24 h 后，在培養(yǎng)物中檢測到了大量牛蒡苷元，表明大部分底物牛蒡苷的4'位葡萄糖基已被脫掉。Wang 等[43]研究結(jié)果再次證實，小鼠糞樣菌群對牛蒡苷具有脫糖轉(zhuǎn)化作用。除小鼠糞樣菌群外，將人糞樣菌群與牛蒡苷共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，人糞樣菌群同樣可以將底物牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元[44-45]。

除上述脫糖轉(zhuǎn)化外，Nose 等[42]還發(fā)現(xiàn)小鼠糞樣菌群對脫糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物牛蒡苷元具有進一步轉(zhuǎn)化能力，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，小鼠糞樣菌群能將底物牛蒡苷元3'位甲基脫去，生成3'-去甲基-牛蒡苷元（3'-desmethylarctigenin，3'-DMAG，3）；由于3'-DMAG 為非天然產(chǎn)物，推測小鼠糞樣菌群分泌的相關(guān)酶類將底物牛蒡苷元脫甲基轉(zhuǎn)化為3'-DMAG。Wang 等[43]研究結(jié)果顯示，除牛蒡苷元和3'-DMAG外，小鼠糞樣菌群轉(zhuǎn)化底物牛蒡苷后的代謝產(chǎn)物還包括3'-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（4）等。除小鼠糞樣菌群外，Heinonen 等[44]于2001 年首次證實，人糞樣菌群能將底物牛蒡苷轉(zhuǎn)化為多種不同代謝產(chǎn)物，經(jīng)產(chǎn)物分離鑒定發(fā)現(xiàn)，底物牛蒡苷可被人糞樣菌群轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元以及牛蒡苷元去甲基和去羥基產(chǎn)物。2003 年Xie 等[45]從牛蒡苷與人糞樣菌群共培養(yǎng)物中分離得到6 種牛蒡苷的不同代謝產(chǎn)物，即牛蒡苷元、3'-DMAG、3'-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元、3'，3''-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（5）、3'，3''，4''-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（6）和腸內(nèi)酯（enterolactone，7）；此外，根據(jù)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測了牛蒡苷被人腸道菌群代謝的過程（見圖1）。

圖1 牛蒡苷被人腸道菌群代謝的可能途徑[45]Figure 1 Proposed metabolic pathway of the substrate arctiin by human intestinal flora

3.2 牛蒡苷或牛蒡苷元轉(zhuǎn)化菌株的分離與篩選

2007 年Jin 等[46]將人糞樣菌群與底物牛蒡苷元共培養(yǎng)，首次分離得到一株對牛蒡苷元有轉(zhuǎn)化功能的微生物純培養(yǎng)物，經(jīng)菌種鑒定，將分離得到的純培養(yǎng)物鑒定為厭氧真細菌屬的一個新分類單元，即菌株Eubacteriumsp. ARC-2。研究結(jié)果顯示，在厭氧環(huán)境下與底物牛蒡苷元共培養(yǎng)62 h 后，菌株ARC-2 能將底物牛蒡苷元轉(zhuǎn)化為二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone）、3'-O-甲基醚二羥基腸內(nèi) 酯（dihydroxyenterolactone 3'-O-methyl ether）、3''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone 3''-O-methyl ether）、4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone 4''-O-methyl ether）、4''-去甲基牛蒡苷元（4''-desmethylarctigenin）、3'-DMAG以及3''-去甲基牛蒡苷元（3''-desmethylarctigenin）等7 種不同代謝產(chǎn)物。僅從高效液相色譜圖所示代謝產(chǎn)物峰的峰面積來看，3''-去甲基牛蒡苷元和4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯這2 種產(chǎn)物的峰面積較大； 通過硅膠柱對產(chǎn)物進行分離，并對得到的各代謝產(chǎn)物進行量化分析顯示，菌株ARC-2 代謝底物牛蒡苷元后生成的二羥基腸內(nèi)酯和4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯的含量最多。另外，值得一提的是菌株ARC-2 代謝底物牛蒡苷元所生成的7 種代謝產(chǎn)物中并不包括腸內(nèi)酯。

2013 年筆者實驗室從人糞樣菌群中分離得到一株能將底物牛蒡苷或牛蒡苷元高效轉(zhuǎn)化為3'-DMAG的嚴格厭氧細菌菌株，經(jīng)菌種鑒定，將分離得到的菌株鑒定為布勞特菌屬（Blautia）的一個新分類單元，并將菌株命名為Blautiasp. AUH-JLD56[47]。2017 年，筆者實驗室以3'-DMAG 為底物，分離得到對3'-DMAG 具有轉(zhuǎn)化功能的單一細菌菌株Eggerthellasp. AUH-JLD49s，該菌株為嚴格厭氧細菌菌株；菌株AUH-JLD49s 在厭氧條件下能將底物3'-DMAG 轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物3'-去甲基-4'-去羥基-牛蒡苷元（3'-desmethyl-4'-dehydroxyarctigenin，DMDHAG）[48]。

腸內(nèi)酯是一種具有類似動物雌激素活性的物質(zhì)，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有手性碳原子，故腸內(nèi)酯為手性化合物（見圖1）。腸內(nèi)酯在自然界中并不存在，只能由木酚素類化合物經(jīng)動物腸道菌群代謝后生成。研究者已分離得到能將油料作物亞麻籽中的木酚素——開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯的特定細菌菌株[49-50]，然而，已分離得到的菌株代謝SDG 后只生成少量腸內(nèi)酯，大部分產(chǎn)物為腸內(nèi)酯合成的前體物質(zhì)腸二醇。以藥食兩用植物牛蒡子中的標志性成分牛蒡苷為底物，利用哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化生成腸內(nèi)酯雖已有報道，但將牛蒡苷轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯的單一微生物菌株目前國內(nèi)外尚鮮見報道。

4 牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的合成與活性研究

李馥睿等[51]2011 年報道了產(chǎn)物3'-DMAG 的化學(xué)合成方法，但由于合成過程需添加有惡臭和強刺激性的吡啶，加之化學(xué)合成反應(yīng)步驟多，所需成本相對較高，目前尚鮮見市場銷售化學(xué)合成的3'-DMAG。迄今，除人工合成的腸內(nèi)酯有銷售外，目前圖1 中涉及的牛蒡苷元的其他代謝產(chǎn)物均鮮見銷售。由于3'-DMAG 及DMDH-AG 等產(chǎn)物匱乏，有關(guān)牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的活性報道目前非常有限。Jin等[52]2013 年利用菌株Eubacteriumsp. ARC-2 在厭氧條件下合成牛蒡苷元的不同代謝產(chǎn)物，并分析牛蒡苷元以及7 個代謝產(chǎn)物與雌激素受體ERα的親和力。結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物對ERα的親和力大小與底物被脫去的甲基的數(shù)目有關(guān)，其中脫掉2 個甲基的代謝產(chǎn)物對ERα的親和力均顯著高于脫掉1 個甲基的代謝產(chǎn)物。

為進一步研究牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的活性，筆者實驗室通過高效液相色譜法制備了產(chǎn)物3'-DMAG，并對比分析了底物牛蒡苷元和產(chǎn)物3'-DMAG 對DPPH自由基的體外清除能力。結(jié)果顯示，在0.025 ～ 0.100 mmol · L-1范圍時，產(chǎn)物 3'-DMAG 對 DPPH 自由基的清除能力均顯著高于底物牛蒡苷元（P＜ 0.01），但購買的腸內(nèi)酯對DPPH 自由基的體外清除能力明顯較弱[47]。另外，產(chǎn)物3'-DMAG 對人肝癌細胞株HepG2 具有明顯的體外抑制作用，可影響HepG2 的細胞周期，并誘導(dǎo)線粒體內(nèi)凋亡的發(fā)生；小鼠體內(nèi)實驗研究結(jié)果顯示，產(chǎn)物3'-DMAG 顯著抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，且未表現(xiàn)出任何毒性[53]。由于菌株Blautiasp. AUH-JLD56 為嚴格厭氧細菌，制備產(chǎn)物3'-DMAG 必須在嚴格厭氧環(huán)境下進行，而長期維持嚴格厭氧環(huán)境則需要大量資金投入。為此，筆者實驗室正在對菌株AUH-JLD56 進行耐氧馴化嘗試，以期獲得在有空氣氧條件下既能生長，同時又具有轉(zhuǎn)化活性的耐氧突變株。

在牛蒡苷元所有代謝產(chǎn)物中，只有終產(chǎn)物腸內(nèi)酯目前可進行人工化學(xué)合成，但由于合成步驟多，且產(chǎn)物純化困難，導(dǎo)致腸內(nèi)酯目前售價較高。在腸內(nèi)酯的生物合成方面，楊東輝等[54]利用哺乳動物腸道菌群轉(zhuǎn)化木酚素為腸二醇和腸內(nèi)酯，哺乳動物腸道菌群經(jīng)傳代50 次后對轉(zhuǎn)化結(jié)果無明顯影響，但不足之處是腸道菌群在厭氧環(huán)境中轉(zhuǎn)化木酚素為腸內(nèi)酯的產(chǎn)率較低（低于30%）。另外，轉(zhuǎn)化SDG為腸內(nèi)酯的單一細菌菌株雖已有報道，但已報道的菌株轉(zhuǎn)化木酚素為腸內(nèi)酯的能力極低，腸內(nèi)酯尚不能通過已分離得到的菌株進行生物合成。目前已知，腸內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)激素平衡、抗氧化、抗癌、降低心血管發(fā)病率、減少骨質(zhì)流失以及緩解脂多糖誘發(fā)性炎癥等多種生理功能[55-57]。腸內(nèi)酯為手性化合物，分布于油料作物亞麻籽中的木酚素SDG 為右旋SDG，經(jīng)哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化后生成的腸內(nèi)酯為右旋腸內(nèi)酯[58-59]；牛蒡子中的牛蒡苷為左旋牛蒡苷，經(jīng)哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化后生成的腸內(nèi)酯為左旋腸內(nèi)酯[59]。由于化合物資源匱乏，有關(guān)右旋腸內(nèi)酯和左旋腸內(nèi)酯在藥理或生理功能上的差異目前尚不清楚。

5 結(jié)語

人體腸道內(nèi)寄居著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物菌群，腸道菌群能否保持平衡對維持人體健康至關(guān)重要。目前已知，日常飲食、長期壓力、行為習(xí)慣以及抗生素使用等多種因素均會對腸道菌群產(chǎn)生影響。湯劑口服劑型為中藥臨床主要使用方式，中藥在機體代謝的必經(jīng)之路為消化道?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，單一成分、單味中藥和中藥復(fù)方對腸道菌群均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，且調(diào)節(jié)作用主要是通過促進有益菌生長和抑制有害菌的過度增殖來實現(xiàn)，有關(guān)其他方面的調(diào)節(jié)機制尚有待進一步研究。另一方面，大量研究結(jié)果證實，腸道菌群中的某些特定菌株對中藥活性成分具有代謝功能，如單味中藥牛蒡子，其主要活性成分經(jīng)人腸道細菌菌株代謝后可生成7 種不同代謝產(chǎn)物，由于這些代謝物具有不同于底物牛蒡苷元的生物學(xué)活性，中藥本身的藥效將因腸道菌群的代謝而發(fā)生改變。反過來，中藥經(jīng)這些微生物代謝所得產(chǎn)物是否又會繼續(xù)影響人腸道菌群的構(gòu)成或其他方面，目前尚鮮見相關(guān)報道。