人X染色質(zhì)制備方法改進(jìn)

王 劍，張錦萍，張中林

（遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101）

正常女性體細(xì)胞核中的一對(duì)X染色體在分裂間期只有一個(gè)有活性，呈常染色質(zhì)狀態(tài)，另一個(gè)無(wú)活性，螺旋化呈異固縮狀態(tài)，緊貼核膜內(nèi)緣，形成直徑約為1μm的橢圓形濃染小體，稱為X染色質(zhì)，亦稱Barr小體（Barr body）[1]。該失活的X染色體可以來(lái)自父方，也可以來(lái)自母方，失活發(fā)生于胚胎發(fā)育第16天，一旦失活，那么由此細(xì)胞增殖產(chǎn)生的所有子代細(xì)胞也總是這一條X染色體失活[1]。間期核內(nèi)X染色質(zhì)數(shù)目等于X染色體數(shù)目減1，正常女性每個(gè)體細(xì)胞中應(yīng)見(jiàn)到1個(gè)X染色質(zhì)，正常男性體細(xì)胞中見(jiàn)不到X染色質(zhì)。失活X染色體上的基因不是全部失活，一部分仍有轉(zhuǎn)錄活性，故個(gè)體X染色體數(shù)目異常者表型有別于正常個(gè)體[1]。因此，人X染色質(zhì)的制備與觀察在臨床廣泛用于醫(yī)學(xué)需要的胎兒性別鑒定和性染色體數(shù)目異常疾病的診斷，是高職醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)課程中的一個(gè)重要的教學(xué)實(shí)驗(yàn)[2]。經(jīng)過(guò)數(shù)輪教學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)人X染色質(zhì)的傳統(tǒng)制備方法加以改進(jìn)，制片效果更好，且可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約硫堇染液。

一、材料和方法

（一）器材

器材包括光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、水浴箱、載玻片、蓋玻片、清潔紗布、牙簽、滴管、吸水紙、紅藍(lán)鉛筆、染色缸、片架等。

（二）試劑

試劑包括香柏油、清潔劑（乙醚7份+無(wú)水乙醇3份）、70%乙醇、95%乙醇、蒸餾水、5 mol/L HCl溶液、硫堇染液等。

（三）方法

方法為乙醇固定法。受檢女性用清水漱口，以牙簽鈍端刮取口腔頰部粘膜表面上皮細(xì)胞（同一方向刮取幾行），棄去第一次刮取物，用第二次刮取物。用紅藍(lán)鉛筆在載玻片左側(cè)寫(xiě)上編號(hào)或?qū)W號(hào)或姓名，中央畫(huà)出涂片范圍（直徑1 cm圓圈），將刮取的上皮細(xì)胞涂片（牙簽鈍端側(cè)面貼緊玻片滾動(dòng)前行，涂完一行，同法涂下一行，不要來(lái)回涂抹，涂片范圍在所畫(huà)圓圈之內(nèi)）。標(biāo)本片稍晾干，置95%乙醇中固定20～30分鐘。取出標(biāo)本片晾干，蒸餾水中漂洗3次（每次漂洗之后換水）。浸入30℃的5 mol/L HCl溶液中水解20～30分鐘，取出后蒸餾水中漂洗3次（即每次漂洗之后換水）。硫堇染液染色30分鐘（滴加1滴硫堇染液于所畫(huà)圓圈中央，輕輕晃動(dòng)標(biāo)本片使硫堇染液散布于所畫(huà)圓圈之內(nèi)），然后在蒸餾水中漂洗3次（即每次漂洗之后換水）。70%乙醇中分色處理5分鐘，蒸餾水漂洗。加蓋片鏡檢，先在低倍鏡下選擇典型的細(xì)胞核，再轉(zhuǎn)換高倍鏡、油鏡，仔細(xì)尋找、觀察X染色質(zhì)。

二、結(jié)果

低倍鏡下可見(jiàn)女性口腔黏膜上皮細(xì)胞核為圓形或橢圓形，染成紫藍(lán)色，選擇典型的細(xì)胞核應(yīng)該是核較大，染色清晰，輪廓清楚無(wú)缺損。油鏡下觀察X染色質(zhì)的特征是，緊貼核膜內(nèi)側(cè)緣，染色深，輪廓清晰，呈圓形、扁平形、三角形或饅頭形，大小約 1.5μm （見(jiàn)圖 1）。

三、討論

人X染色質(zhì)是女性在胚胎發(fā)育第16天，兩條X染色體中隨機(jī)一條發(fā)生異染色質(zhì)化而失活，一旦失活，那么由此細(xì)胞增殖產(chǎn)生的所有子代細(xì)胞也總是這一條X染色體失活。失活X染色體上的基因不是全部失活，一部分仍有轉(zhuǎn)錄活性，故個(gè)體X染色體數(shù)目異常者表型有別于正常個(gè)體。間期核內(nèi)X染色質(zhì)數(shù)目等于X染色體數(shù)目減1，正常女性每個(gè)體細(xì)胞中應(yīng)見(jiàn)到1個(gè)X染色質(zhì)，正常男性體細(xì)胞中見(jiàn)不到X染色質(zhì)。

圖1 人X染色質(zhì)（油鏡下）

XO女性：體細(xì)胞核中觀察不到X染色質(zhì)，臨床表現(xiàn)為身材矮小，身高一般低于150厘米；生殖器與第二性征不發(fā)育，女性外陰發(fā)育幼稚、有陰道、子宮小或缺如，乳頭間距大、乳房及乳頭均不發(fā)育；軀體發(fā)育異常，多痣、眼瞼下垂、耳大位低、腭弓高、后發(fā)際低、頸短而寬、胸廓桶狀或盾形等，智力發(fā)育程度不一，壽命與正常人同。XXX女性體細(xì)胞核中可見(jiàn)到兩個(gè)X染色質(zhì)，一般發(fā)育正常，但智力低下，外生殖器無(wú)異常，性腺發(fā)育不良，大多卵巢內(nèi)有正常卵泡，部分患者有小子宮。

XXY男性體細(xì)胞核中可觀察到一個(gè)X染色質(zhì)，患者表現(xiàn)為睪丸小而硬、曲細(xì)精管纖維化、透明樣變，管腔閉塞，無(wú)精子發(fā)生，男性第二性征發(fā)育差，有女性化表現(xiàn)，如無(wú)胡須、體毛少、陰毛分布如女性、陰莖龜頭小等，約25%的患者有乳房發(fā)育、身材高、四肢長(zhǎng)、部分智力低下，有的精神異常有精神分裂癥傾向。

隨著對(duì)X染色質(zhì)深入研究，如劑量補(bǔ)償作用[3]、XIST RNA與X染色質(zhì)共域[4]等，X染色質(zhì)異常與疾病的關(guān)系將逐漸被揭示。人X染色質(zhì)的制備與觀察可用于鑒定醫(yī)學(xué)需要的胎兒性別和診斷性染色體數(shù)目異常的疾病，廣泛應(yīng)用于臨床，也是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)一個(gè)重要的教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

我們按照傳統(tǒng)制備方法經(jīng)過(guò)幾輪教學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)效果不太理想，而且4學(xué)時(shí)的實(shí)驗(yàn)課時(shí)間也不太充足，于是我們查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，目前X染色質(zhì)制備方法有涂片法和滴片法[5]兩大類。染色方法有Giemsa染色、甲苯胺藍(lán)染色[6]、石炭酸復(fù)紅染液染色[7]、硫堇染色[8-10]等。我們選擇對(duì)人X染色質(zhì)的傳統(tǒng)制備方法[11]（涂片法-硫堇染色）進(jìn)行改進(jìn)，利用課余時(shí)間多次摸索，改進(jìn)之后，制片效果更好，且可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約硫堇染液。

一是涂片方法的改進(jìn)：傳統(tǒng)方法將刮取的上皮細(xì)胞涂在潔凈的載玻片上，平推成薄層細(xì)胞平鋪片。而平推不易使得細(xì)胞單層均勻鋪開(kāi)，易造成有的地方細(xì)胞比較分散，有的地方細(xì)胞重疊，故觀察效果不理想。我們對(duì)涂片方法加以改進(jìn)，以牙簽鈍端側(cè)面貼緊玻片滾動(dòng)前行，使細(xì)胞單層均勻鋪開(kāi)在紅藍(lán)鉛筆預(yù)先畫(huà)好的直徑1 cm圓圈范圍之內(nèi)，涂完一行，同法再涂下一行，不要來(lái)回涂抹。

二是染片方法的改進(jìn)：傳統(tǒng)方法將標(biāo)本片不重疊擺放于平皿內(nèi)，加硫堇染液沒(méi)過(guò)標(biāo)本片染色，這樣需要的硫堇染液比較多，造成浪費(fèi)（如果將標(biāo)本片插入片架置于染缸內(nèi)染色，所需硫堇染液更多很多）。我們將硫堇染液裝入小塑料滴瓶中，每張標(biāo)本片滴加1滴硫堇染液于所畫(huà)圓圈中央，輕輕晃動(dòng)標(biāo)本片使硫堇染液散布于所畫(huà)圓圈之內(nèi)，如此染片所需硫堇染液大大減少，節(jié)約很多，而且整張標(biāo)本片很干凈，也便于之后蒸餾水漂洗。

三是分色時(shí)間的改變：傳統(tǒng)方法硫堇染液染色30分鐘后，蒸餾水洗3次，50%乙醇中漂洗1次，70%乙醇中分色處理15～30分鐘，蒸餾水漂洗，然后初步鏡檢：若染色過(guò)深，繼續(xù)分色；若染色過(guò)淺，則放硫堇染液中再染。經(jīng)過(guò)幾輪教學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)分色太過(guò)，觀察效果不太理想，如果繼續(xù)染色，4學(xué)時(shí)的實(shí)驗(yàn)課時(shí)間又不太充足，于是我們利用課余時(shí)間多次摸索，確定70%乙醇中分色處理5分鐘即可，然后蒸餾水漂洗，加蓋片鏡檢。學(xué)生實(shí)驗(yàn)課如此制備X染色質(zhì)，絕大多數(shù)觀察都比較理想，先在低倍鏡下選擇較大、染色清晰、輪廓清楚無(wú)缺損的典型細(xì)胞核，再轉(zhuǎn)換高倍鏡、油鏡，可以觀察到緊貼核膜內(nèi)側(cè)緣、染色深、輪廓清晰、呈圓形、三角形或饅頭形的X染色質(zhì)，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，為人X染色質(zhì)的制備實(shí)驗(yàn)臨床和教學(xué)提供參考。