順鉑聯(lián)合雷帕霉素或3-甲基腺嘌呤對肺腺癌A549細(xì)胞抑制作用的研究

卜靜 杜蕓 紀(jì)曉坤 吳家寧

肺癌的發(fā)病率和病死率位居中國惡性腫瘤首位[1-2]，因其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時往往處于中晚期，而化療耐受一度嚴(yán)重威脅著患者的生存[3-4]。故而提高肺癌細(xì)胞對各種化療藥物的敏感性以及降低其耐藥性亟待解決。自噬作為一種應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制，在各種應(yīng)激條件下，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)成分(細(xì)胞器和蛋白質(zhì))的持續(xù)循環(huán)，并在營養(yǎng)缺乏時提供一種替代能源促進(jìn)細(xì)胞本身的存活[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，許多癌細(xì)胞較正常細(xì)胞的自噬水平低，并且自噬水平可以通過一些治療手段來激活[9]。自噬像一把雙刃劍，因細(xì)胞所處不同的內(nèi)環(huán)境及疾病發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，如它在腫瘤發(fā)生初期和晚期分別抑制和促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[10-11]。雷帕霉素(rapamycin, RAPA)通過抑制真菌、哺乳動物細(xì)胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號通路主要通過調(diào)控下游分子的活性來控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[12-13]，它在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡中也起到重要的控制作用[14]。在一定條件下，通過抑制自噬作用，使細(xì)胞持續(xù)不斷地生長增殖[15-18]。此外，在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌等多種疾病中報道，持續(xù)的PI3K/Akt/mTOR 信號激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，能抑制細(xì)胞凋亡、加速細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[19]。

順鉑(cisplatin, CP) 作為臨床上廣為應(yīng)用的含鉑類化療藥物，在肺癌、食管癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌的化療中具有重要的地位，但是順鉑耐藥性的存在限制了它在臨床上的應(yīng)用。順鉑主要通過干擾RNA復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到抗癌作用，但凋亡與自噬的交互作用有待詳述[20]。雷帕霉素作為自噬的激動劑，與mTOR結(jié)合后，阻止細(xì)胞周期中DNA合成前期(G1)向DNA合成期(S)的轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)抗增殖作用。大量的數(shù)據(jù)表明雷帕霉素與其他靶向藥物或放化療聯(lián)合使用可能增強(qiáng)抗腫瘤作用和克服藥物耐受性。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)，一種自噬體形成所必須的酶-Ⅲ型PI3K抑制劑，可以抑制自噬的發(fā)生。

目前，以mTOR為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療正在從單一應(yīng)用mTOR抑制劑向聯(lián)合其他靶向藥物和放化療發(fā)展，在提高療效和預(yù)防耐藥性方面有望取得進(jìn)一步突破。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅱ)作自噬的特異性標(biāo)記物，在自噬發(fā)生后，連接于形成的自噬泡。Bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，定位于細(xì)胞漿，主要在凋亡的執(zhí)行階段發(fā)揮作用。

2013年3月至2014年6月，筆者通過檢測順鉑分別聯(lián)合雷帕霉素或3-MA后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax基因和蛋白的表達(dá)水平，深入了解自噬與凋亡對肺腺癌A549細(xì)胞的作用，為提高順鉑的療效提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞株A549由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

2.實(shí)驗(yàn)藥物：順鉑(齊魯制藥公司)、噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO；重慶東方試劑總廠)、雷帕霉素(rapamycin；上海碧云天生物技術(shù)研究所)、3-MA(Sigma公司)。

二、藥物濃度的確定及分組

實(shí)驗(yàn)分為對照組和4個藥物組。對數(shù)生長期A549細(xì)胞(濃度1.0×106/ml)200 μl每孔接種于96孔板，過夜。細(xì)胞貼壁后加入雷帕霉素，使其終濃度分別為0.1 nmol/L、1.0 nmol/L、10.0 nmol/L、100.0 nmol/L，對照組和藥物組均設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，加入MTT(濃度5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h，棄上清后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，振蕩5 min，Bio-Rad酶標(biāo)儀讀取吸光度值(A值)(測試波長570 nm，濾過波長655 nm)。用GraphPad Prism 5軟件計算出雷帕霉素的50%細(xì)胞抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)。同理求出順鉑和3-MA的IC50值。最終得到順鉑IC50：15 μmol/L；雷帕霉素IC50：10 nmol/L；3-MA IC50：3 μmol/L。并以此作為實(shí)驗(yàn)濃度。

藥物分組：對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(濃度1.0×106/ml)，細(xì)胞鋪滿孔底面積70%～80%后加入藥物，對照組(無藥物干預(yù))、順鉑組(加15 μmol/L的順鉑)、順鉑+雷帕霉素組(加10 nmol/L的雷帕霉素1 h后再加15 μmol/L的順鉑)、順鉑+3-MA組(加3 μmol/L的3-MA 1 h后再加15 μmol/L的順鉑)。

三、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞鋪滿孔底時在孔底中間位置劃一細(xì)痕，分為上述4組并加入相應(yīng)藥物，于劃痕后24 h，48 h和72 h時，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕中間遷移的距離并照相。

四、RT-PCR法

1.實(shí)驗(yàn)試劑和引物：引物序列：mTOR擴(kuò)增產(chǎn)物191 bp：上游引物5′-GGCCTGGATGGCAACTACAGA-3′，下游引物5′-TGCTGGCCAGCAGAGTAGGAA-3′，LC3-Ⅱ擴(kuò)增產(chǎn)物138 bp：上游引物5′-GAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGG-3′，下游引物：5′-GTGTCCGTTCACCAACAGGAAG-3′，Bax擴(kuò)增產(chǎn)物120 bp:上游引物5′-GGCCGGGTTGTCGCCCTTTT-3′,下游引物5′-CCGCTCCCGGAGGAAGTCCA-3′內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物172 bp：上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。

2. mTOR、LC3-Ⅱ及Bax基因總mRNA的提取：用Trizol一步法提取總mRNA。測定A：A260/280(1.8～2.0)，放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：應(yīng)用RT-PCR法檢測mTOR、LC3-Ⅱ及Bax基因mRNA的表達(dá)水平。取出RNA 5 μg按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海生工生物公司)推薦的25 μl體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20 ℃冰箱備用。

4. PCR反應(yīng)：以合成的cDNA作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系20 μl，包括cDNA 2.0 μl，上、下游引物各0.4 μl，2×Super Real PreMinx 10.0 μl，加無RNA酶水7.2～20 μl。反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

5. 計算2-△△Ct值：ΔCt=各組Ct值-組內(nèi)相應(yīng)內(nèi)參的Ct值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)ΔCt-對照ΔCt，各組相對表達(dá)量=2-△△Ct。

五、Western blot法

1.細(xì)胞總蛋白的提取：(1)備好冰盒、EP管、槍、槍頭、磷酸鹽緩沖液(PBS)、離心機(jī)(BIOFUGE PRIMOR低溫離心機(jī)，美國Therm公司)。(2)棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，冷PBS清洗2遍.(3)將細(xì)胞刮下，移至EP管中，8000×g離心5 min。(4)棄上清，用PBS洗滌，8000×g離心5 min。(5)根據(jù)細(xì)胞多少，提前將所需細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)按100∶1混合。(6)將混合后的試劑加入洗好的細(xì)胞中，吹打混勻，冰上靜置15 min。(7)用1 ml注射器吹打20次左右，冰上靜置20 min。(8)10 800×g離心20 min，取上清于另一EP管中，凍于-80 ℃冰箱保存。

2. 蛋白濃度的測定：將待測蛋白濃度樣品適當(dāng)體積加入到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液并定容至20 μl。每孔均加入0.2 ml聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)工作液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置20～30 min。測定A570值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得樣品的蛋白濃度。

3. 制膠及上樣：(1)制備15%分離膠，過程為清洗制膠所用的玻璃板，在制膠所用的燒杯中加入2.3 ml蒸餾水，5 ml 30%丙烯酰胺，2.5 ml 1.5 mol三羥甲基氨基甲烷(-Tris)，0.1 ml 10%十二烷基環(huán)酸鈉(SDS)，0.1 ml 10%過硫酸銨(APS)，0.004 ml四甲基乙二胺(TEMED)，制備15%的分離膠，充分混勻，快速將膠注入兩玻璃板之間，然后在膠上方加入少量蒸餾水來隔絕空氣，室溫約30 min，分離膠凝固，此時，膠和水之間出現(xiàn)明顯界限。(2)制備5%濃縮膠，過程為在制膠所用的燒杯中加入3.4 ml蒸餾水，0.83 ml 30%丙烯酰胺，0.63 ml 1.0 mol-Tris，0.05 ml 10% SDS，0.05 ml 10% APS，0.005 ml TEMED，制備5%濃縮膠，快速注入兩玻璃板之間至其上緣，插入樣品孔梳，置室溫下約1 h至膠凝固。(3)上樣。將膠固定于電泳槽中后，加入1×SDS電泳緩沖液，然后小心緩慢拔去梳子(注意雙方用力均衡，可用5 ml注射器，用電泳液吹打各孔，確保各孔壁堅實(shí)，必要時，用針頭將各孔調(diào)節(jié)均勻)。將變性的蛋白小心加入到各孔中，樣品50～100 μg/孔，Marker 2.5～3.0 μl/孔。

4. SDS-PAGE電泳:濃縮膠80 V恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑電泳至分離膠界面時切換至120 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑距玻璃板下緣1 cm時，停止電泳(此時可見到明顯的Marker條帶)。

5. 轉(zhuǎn)膜及封閉：準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜液，撬開玻板，除去濃縮膠，將分離膠移入轉(zhuǎn)膜液中平衡20 min左右。PVDF膜在100%甲醇中浸泡激活3～5 min后進(jìn)入轉(zhuǎn)膜液中平衡5 min。依次將下列物品從上至下組裝：濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙。根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量大小恒流(恒流是轉(zhuǎn)膜的一種方式)200～250 mV 轉(zhuǎn)膜1.5～2 h。轉(zhuǎn)好膜后，取出PVDF膜，放入封閉液中，室溫保存1 h。

6. 免疫顯色：TBST膜加一抗(mTOR、Lc3-Ⅱ、Bax)及紅外標(biāo)記的熒光二抗后將其轉(zhuǎn)移至 Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)中，采集圖像并分析，測定灰度值。

7. 結(jié)果判定：以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)測出各條帶的灰度值，并對其進(jìn)行分析：目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

比較4組中藥物對A549細(xì)胞的遷移能力：24 h時順鉑聯(lián)合雷帕霉素對肺癌A549細(xì)胞的遷移力最弱；而48 h和72 h時順鉑聯(lián)合3-MA對A549細(xì)胞的遷移力最弱(圖1)。

CP=順鉑、RAPA=雷帕霉素、3-MA=3-甲基腺嘌呤圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)中肺腺癌A549細(xì)胞在對照組與藥物組中0、24、48、72 h的遷移情況

二、各組mTOR、LC3-Ⅱ及Bax的RT-PCR的檢測結(jié)果

1.RT-PCR結(jié)果顯示：24 h，順鉑+雷帕霉素組與順鉑組相比，LC3-ⅡmRNA的2-△△Ct值明顯上升，mTOR mRNA2-△△Ct值明顯降低；順鉑組Bax mRNA 的2-△△Ct最高，與其他組相比相對表達(dá)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2. 48 h和72 h 順鉑+雷帕霉素組仍顯示較高的LC3-ⅡmRNA的2-△△Ct值；而順鉑+3-MA組則顯示較低的mTOR mRNA的2-△△Ct值和較高的Bax mRNA的2-△△Ct值,與其他組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 4組m-TOR、LC3-Ⅱ和Bax mRNA在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中不同時間的2-△△Ct值

注CP=順鉑、RAPA=雷帕霉素、3-MA=3-甲基腺嘌呤

Control=對照、CP=順鉑、RAPA=雷帕霉素、3-MA=3-甲基腺嘌呤圖2 4組m-TOR、LC3-Ⅱ和Bax 蛋白在Western blot實(shí)驗(yàn)中48 h的相對表達(dá)量

Control=對照、CP=順鉑、RAPA=雷帕霉素、3-MA=3-甲基腺嘌呤圖3 4組m-TOR、LC3-Ⅱ和Bax 蛋白在Western blot實(shí)驗(yàn)中72 h的相對表達(dá)量

三、各組mTOR、LC3-Ⅱ及Bax蛋白表達(dá)影響的情況

Western blot結(jié)果顯示：48 h和72 h，順鉑+雷帕霉素組LC3-Ⅱ相對表達(dá)量明顯上升；順鉑+3-MA 組mTOR的相對表達(dá)量明顯降低，Bax的相對表達(dá)量明顯上升；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2、3，表2)。

討 論

非小細(xì)胞癌(non small cell lung cancer, NSCLC)作為全球癌癥死亡中最常見的原因，嚴(yán)重威脅著人類的健康[21]。NSCLC缺乏特定的癥狀和體征，2/3以上的患者在確診時已處于中晚期[22]，而化療藥物耐受常導(dǎo)致治療效果不盡人意。如何減少耐藥率發(fā)生，進(jìn)而尋求新的藥物靶點(diǎn)，從而提高化療效果，成為腫瘤治療中亟待解決的問題。

表2 4組m-TOR、LC3-Ⅱ和Bax 蛋白在Western blot實(shí)驗(yàn)中不同時間的相對表達(dá)量

注CP=順鉑；RAPA=雷帕霉素；3-MA=3-甲基腺嘌呤

一、自噬與其腫瘤抑制作用

自噬作為真核細(xì)胞程序性死亡的方式之一，在營養(yǎng)缺乏、缺氧或有毒物質(zhì)等環(huán)境下利用自身溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，主要是通過對細(xì)胞內(nèi)長壽命蛋白、細(xì)胞器的降解和再利用對細(xì)胞生命活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。自噬在腫瘤細(xì)胞生長中起著雙重作用，適度的自噬水平能夠作為一種保護(hù)因子參與各種生理病理過程，如清除衰老、損傷的細(xì)胞器或再利用自身物質(zhì)以抵抗?fàn)I養(yǎng)缺乏等；相反，過度的自噬激活會引發(fā)大量的自噬性細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制或死亡。

雷帕霉素作為自噬的激動劑，與mTOR結(jié)合后，阻止細(xì)胞周期 G1 期向 S 期的轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)抗增殖作用。有數(shù)據(jù)表明，50%～70%的非小細(xì)胞肺癌存在PI3K/mTOR信號通路異常激活[23]。雷帕霉素通過抑制真菌、哺乳動物細(xì)胞中mTOR的活性，使Atg13去磷酸化和活化Atg1從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[24]。大量的數(shù)據(jù)表明，雷帕霉素與其他靶向藥物或放化療聯(lián)合使用可能增強(qiáng)抗腫瘤作用和克服對藥物的耐受性[25]。

二、抑制PI3K/Akt通路的抗腫瘤作用

PI3K/Akt/mTOR通路作為體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過程中扮演著至關(guān)重要的作用，該通路的激活在一定程度上不僅可以降低癌細(xì)胞的凋亡水平，同時還可以抑制細(xì)胞的自噬水平，對癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。m-TOR作為自噬啟動階段因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在激活后抑制自噬的發(fā)生。Pisick等[26]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PI3K抑制劑能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，從而增加化療的敏感性；而解除對PI3K/Akt/mTOR通路的調(diào)控可以促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展。目前已知，雷帕霉素可以有效抑制人NSCLC細(xì)胞的生長，且其與多西他賽聯(lián)合使用對抑制肺癌細(xì)胞的生長均表現(xiàn)為協(xié)同作用，雷帕霉素生物活性的發(fā)揮依賴于其特殊的分子作用靶點(diǎn)[27-28]。順鉑主要通過干擾RNA復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到抗癌作用，對自噬與順鉑的關(guān)系尚不明確。PI3K/Akt通路的激活可使Bax的Ser184殘基磷酸化而失活，從而抑制細(xì)胞的凋亡[29]，Akt可以通過磷酸化mTOR，抑制其下游分子如p70S6K、4E-BP1傳遞生存信號，抑制不依賴于p53的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞生存[30]。

三、順鉑、雷帕霉素和3-MA抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長機(jī)制

自噬和凋亡作為正常的程序性細(xì)胞死亡方式，在維持機(jī)體的生命活動中作用突出，但人們對二者如何相輔相成的合作卻知之甚少。筆者考慮能否疊加二者的抗癌效應(yīng)，從而提高放療、化療的敏感性。前期實(shí)驗(yàn)中將自噬因子Beclin1導(dǎo)入食管TE1(人食管癌細(xì)胞)細(xì)胞，結(jié)果提示反應(yīng)性自噬活性可能與順鉑耐藥有關(guān)[31]。本研究通過應(yīng)用自噬激動劑和抑制劑來探討結(jié)果是否一致。

本研究發(fā)現(xiàn)順鉑、雷帕霉素和3-MA均可抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長，且抑制作用隨藥物濃度和時間的增加而增強(qiáng)。24 h，順鉑+雷帕霉素組對A549細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)；48 h和72 h，順鉑+3-MA 組的抑制作用最強(qiáng)，且具有較高的Bax表達(dá)水平。Chen等[32]報道，自噬的抑制增強(qiáng)了凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的增殖抑制和凋亡。筆者推測，自噬與凋亡的結(jié)合可能使腫瘤抑制作用增強(qiáng)；3-MA在抑制自噬的過程中可能反向激活凋亡并使凋亡占據(jù)主導(dǎo)作用，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。

四、展望

內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持是生物體保持健康的必要前提，前者的動蕩會打破細(xì)胞增殖與死亡之間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。PI3K/Akt/mTOR信號通路可以通過調(diào)節(jié)自噬、凋亡等多種途徑誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，經(jīng)藥物阻斷信號通路下游的分子活化從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，可以明顯抑制腫瘤生長，提高化療的療效。

本研究通過抑制或激活自噬觀察與順鉑誘導(dǎo)凋亡之間的關(guān)系，通過RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)，從mRNA到蛋白水平敘述了m-TOR、LC3-Ⅱ和Bax三者之間的變化，得出在順鉑用藥中抑制自噬可能激活凋亡從而增加A549細(xì)胞對順鉑的敏感性。但該現(xiàn)象是否存在于其他化療藥物中有待進(jìn)一步證實(shí)。此外人們對PI3K/Akt/mTOR信號通路的詳細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制及如何與其他信號通路相互作用了解不夠深入。故在深入研究各信號通路的前提下，尋找新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，針對關(guān)鍵通路的信號分子研發(fā)藥物，可為腫瘤靶向治療或?yàn)樘岣叻暖?、化療敏感性提供理論依?jù)。