金華豬精液冷凍保存技術(shù)研究

章嘯君，屠平光，項(xiàng) 云

(金華農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321007)

1 引言

精液冷凍保存就是利用干冰(-79 ℃)、液氮(-196 ℃)或其它制冷設(shè)備作為冷源，將精液經(jīng)過特殊處理后，保存在極低溫度下，完全抑制了精子的代謝活動(dòng)，使精子的生命在休眠狀態(tài)下保存下來，升溫后復(fù)蘇而不失去受精能力，使精液達(dá)到長期保存的方法。這項(xiàng)技術(shù)極大限度的提高了優(yōu)良種公畜的利用率，減少公畜的飼養(yǎng)量以及疾病的傳播，有利于家畜品種的雜交改良，加快遺傳進(jìn)展。1956年，英國人ploge開始研究豬精液冷凍保存技術(shù)。在1950～1960期間的研究中，利用牛精液冷凍方法冷凍豬精液，解凍后的精子具有活力，但是沒有受精能力[1]。 1970年，Ploge[2]首次報(bào)道，用腹腔手術(shù)授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管，獲得83%的受精卵，并得到凍精生產(chǎn)的小豬。目前，豬精液冷凍保存技術(shù)與其他動(dòng)物相比，雖然取得了一些進(jìn)展，但仍然存在著冷凍技術(shù)程序復(fù)雜、冷凍后效果不穩(wěn)定等問題。本試驗(yàn)通過對(duì)金華豬精液冷凍過程中，不同稀釋液、冷凍及解凍方法等各個(gè)方面進(jìn)行研究，從精子活力、畸形率和質(zhì)膜完整率等方面來綜合評(píng)價(jià)冷凍精液的結(jié)果，旨在探索優(yōu)化出金華豬精液較好的冷凍和解凍方法，為建立實(shí)用化的金華豬精液冷凍保存程序提供參考，為今后在金華豬種質(zhì)資源的保存和利用提供可靠的技術(shù)方法。

2 材料與方法

2.1豬精液來源 豬精液采自金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院金華豬選育場金華豬種公豬。

2.2 主要試劑與儀器葡萄糖、檸檬酸鈉、半胱氨酸、Tris等所用試劑均購自Sigma公司,紅寶石精子記數(shù)板WT-2000C、精子程序冷凍儀與精液質(zhì)量分析系統(tǒng)均購自北京田園奧瑞公司。

2.3 稀釋液配方 3種稀釋液分別用10%的檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH值至6.8,抗生素均為青霉素含量為1000 IU/mL、鏈霉索1000 μg/mL。臨用前取冷凍稀釋液和新鮮蛋黃二者比例為80%∶20%混合攪拌均勻，冷卻至17 ℃?zhèn)溆谩?種稀釋液組分，見表1。

表1 3種稀釋液組分

2.4精液采集 手握法采集金華豬公豬精液中段，經(jīng)2層精液過濾紙除去雜質(zhì)，用BTS稀釋液在等溫條件下按1∶1體積比稀釋，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用精液分析儀檢測精子的精子活率和畸形率。最后取精子活力在70%以上，畸形率15%以下的精液用于冷凍保存試驗(yàn)。

2.5精液的稀釋與平衡 采用二步稀釋法，對(duì)原精先用不含甘油的稀釋液稀釋，待溫度慢慢降至5 ℃后，平衡1.5 h,再加入含甘油的稀釋液，甘油的工作濃度為3%,混勻后立即在低溫操作柜中進(jìn)行0.5 mL細(xì)管灌裝。

2.6精液的冷凍 方法一:采用程序冷凍儀冷凍，將封好的細(xì)管置于程序冷凍儀內(nèi)(5 ℃)，以5 ℃/min的降溫速率，從5 ℃降溫至-10 ℃，然后以60 ℃/min的降溫速率，從-10 ℃降溫至-130 ℃，最后投入液氮保存。方法二：采用液氮熏蒸冷凍法，將細(xì)管冷凍架置于裝有液氮的冷凍箱內(nèi)，使細(xì)管距液氮面4 cm處，熏蒸10 min后直接投入液氮保存。

2.7精液解凍 從液氮中取出精液細(xì)管，在水浴中解凍，輕輕搖動(dòng)至融化，解凍條件為37 ℃，30 s、45 ℃，20 s、60 ℃，8 s水浴，用剪刀剪開細(xì)管兩端將精液倒入10 mL裝有解凍液試管中混勻。

2.8精液解凍后洗滌 將解凍后的精液放入離心管中，加入3倍量的洗精液，以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10 min，除去上清液；同樣的洗滌重復(fù)3次。將洗滌好的精液用洗精液稀釋至精子密度在106個(gè)/mL左右，在37 ℃平衡30 min后進(jìn)行精液品質(zhì)的檢查。

2.9精液品質(zhì)的檢查

2.9.1精子活力、畸形率的檢查 分別對(duì)各試驗(yàn)組冷凍后的精液進(jìn)行抽樣檢查，取10 μL精液放在紅寶石精子記數(shù)板中(37 ℃)，使用精液質(zhì)量分析系統(tǒng)分析精子活力、畸形率。

2.9.2精子質(zhì)膜完整性的檢測 本試驗(yàn)采用低滲腫脹法[2],用低滲腫脹實(shí)驗(yàn)(HOST)測定精子樣本的彎尾率即為質(zhì)膜完整率。將精子樣本稀釋到1×106個(gè)/mL，取500 μL加入1 mL低滲液中,置于37 ℃水浴處理60 min；取5 μL精液滴于載玻片上，加蓋玻片后在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，至少計(jì)數(shù)100個(gè)精子。

2.10數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Graphpad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，相關(guān)數(shù)據(jù)采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為存在顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1不同冷凍稀釋液效果比較 從試驗(yàn)數(shù)據(jù)上我們可以看出，Ⅱ、Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液處理組解凍后精子的活力、畸形率和質(zhì)膜完整性都明顯地高于Ⅰ號(hào)冷凍稀釋液(P<0.05)；Ⅱ號(hào)冷凍稀釋液和Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液處理組之間沒有明顯差異(P>0.05)。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同冷凍稀釋液效果比較

注：同列標(biāo)注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標(biāo)注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

3.2不同解凍方法對(duì)精子品質(zhì)的影響 由表3可知，采用60 ℃，8 s方法解凍，精子活力顯著高于其他2組(P<0.05)，畸形率顯著低于37 ℃，30 s組(P<0.05)，但與45 ℃，20 s組相比差異不顯著(P>0.05)。頂體完整率雖高于其他2組，但差異不顯著(P>0.05)。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 不同解凍方法對(duì)精子品質(zhì)的影響

注：同列標(biāo)注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標(biāo)注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

3.3不同冷凍方法對(duì)精子品質(zhì)的影響 由表4可知，采用程序冷凍儀冷凍法，解凍后精子活力顯著優(yōu)于液氮熏蒸冷凍法組 (P<0．05),畸形率、質(zhì)膜完整率與液氮熏蒸冷凍法組相比差異不顯著(P>0.05)。具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 不同冷凍方法對(duì)精子品質(zhì)的影響

注：同列標(biāo)注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標(biāo)注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

4 討論

冷凍稀釋液是精子的保護(hù)劑，可以減弱精子運(yùn)動(dòng)、抑制精子代謝、延長精子體外存活時(shí)間，對(duì)精液冷凍的效果有重要的影響。本試驗(yàn)比較了幾種豬精液冷凍稀釋液的冷凍效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液處理組解凍后精子的活力、 畸形率和質(zhì)膜完整率都明顯地高于Ⅰ號(hào)冷凍稀釋液(P<0.05)；Ⅱ號(hào)冷凍稀釋液和Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液處理組之間沒有明顯差異(P>0.05)。在Ⅱ、Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液中含有半胱氨酸、BsA和Tris,研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸替代部分糖類物質(zhì)有利于提高精液冷凍的效率。氨基酸在精液冷凍-解凍過程中對(duì)精子的保護(hù)作用早以引起重視，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在羊精子的保護(hù)液中加入氨基酸能使精子內(nèi)部結(jié)合比較松的絡(luò)合物的損失大大降低，其效果比糖類要好[3]。同時(shí)，糖類也是保護(hù)劑的重要組成部分，它是一種重要的低溫保護(hù)劑，同時(shí)也能夠?yàn)榫犹峁┠芰浚蜐舛鹊钠咸烟呛腿樘腔旌鲜褂闷淅鋬鲂Ч麑⒋蟠筇岣遊4]，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。BSA作為一種大分子蛋白物質(zhì)，除了可以給精子提供能量外，還可以增加稀釋液的粘稠度，使降溫過程有所緩和，這符合精液稀釋后冷平衡的要求；Tris作為一種良好的緩沖物質(zhì)，可以使稀釋液有一個(gè)穩(wěn)定的pH值，這可能是在精液稀釋后冷平衡過程中保持精子活力和質(zhì)膜完整的一個(gè)重要因素[2]。

冷凍到-196 ℃仍存活的精子只有用適宜的解凍方法，才能確保其復(fù)活。因?yàn)榻鈨鲞^程中精子要兩次經(jīng)過臨界溫度區(qū)(-60 ℃ 和-15 ℃)。適當(dāng)?shù)慕鈨鰷囟饶苁估鋬龅木涌焖僭竭^危險(xiǎn)溫區(qū)，使玻璃化快速越過結(jié)晶態(tài)而直接變?yōu)橐簯B(tài)，降低對(duì)精子的傷害[4]。目前，在大多數(shù)豬精液冷凍研究中普遍采用 37 ℃，30 s條件對(duì)冷凍精液解凍。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了 37 ℃，30 s、45 ℃，20 s和60 ℃，8 s,3種溫度下的解凍效果，發(fā)現(xiàn)60 ℃，8 s解凍更適合于0.5 mL細(xì)管的金華豬凍精解凍。采用該優(yōu)化方案除可獲得較高的精子解凍后活力外，質(zhì)膜完整率 (50.3±3.3)%也較高；精子凍后的畸形率(17.7±1.8)%最低。在一定范圍內(nèi)，隨著解凍溫度上升，精子的活率和頂體完整率也隨之上升。而杜立銀[5]等在研究中也發(fā)現(xiàn)，高溫快速解凍豬冷凍精液的效果好于低溫慢速解凍。在豬精液冷凍液中含有大量卵黃、甘油等物質(zhì)，混合物粘性較大，在低溫下融解速度慢，容易形成冰晶傷害精子，而在相對(duì)高的溫度下，快速解凍可以減少這種傷害[6]。本實(shí)驗(yàn)中的解凍液為BTS，pH值為弱堿性，弱堿性能夠激活精子的運(yùn)動(dòng)性，提高精子活力。但是用堿性稀釋液解凍后精子存活時(shí)間可能要短一些，因此解凍后要及時(shí)輸精或者開展別的實(shí)驗(yàn)。

本試驗(yàn)同時(shí)也對(duì)比了不同冷凍方法對(duì)精子品質(zhì)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：采用程序冷凍儀冷凍法，解凍后精子活力顯著優(yōu)于液氮熏蒸冷凍法組 (P<0.05),畸形率、質(zhì)膜完整率與液氮熏蒸冷凍法組相比差異不顯著(P>0.05)。可能主要是由于液氮熏蒸冷凍法距離液氮面距離較近時(shí)，使精液溫度下降迅速，超過精液承受能力，使解凍后精子活力下降，而如果距離較遠(yuǎn)，則會(huì)使遠(yuǎn)端精液不能快速冷凍，同樣也影響解凍后精子活力下降。

因此采用程序冷凍儀冷凍法，使用Ⅲ號(hào)冷凍稀釋液，在60 ℃，8 s水浴解凍方法更為適合0.5 mL細(xì)管金華豬凍精冷凍保存及解凍。通過本試驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)榻鹑A豬精液的冷凍技術(shù)提供理論支持，為今后在金華豬的種質(zhì)資源保存利用提供可靠的技術(shù)方法。