云南稻核心種質(zhì)秈稻SSR標(biāo)記鑒定

盧玲梅

摘要? ? 水稻核心種質(zhì)是水稻遺傳育種和解析復(fù)雜性狀的重要基礎(chǔ)。本研究以231份表型性狀鑒定為秈稻的核心種質(zhì)、典型秈稻滇屯502和典型粳稻合系35為試驗(yàn)材料，利用能鑒定秈粳稻的10個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行秈粳鑒定，并與利用表型鑒定秈粳稻方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，SSR聚類分析把供試材料大致分為2個(gè)大類群、4個(gè)亞群，供試品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.35～1.00之間，所鑒定品種基本為秈稻品種，鑒定結(jié)果和表型性狀鑒定結(jié)果基本吻合。

關(guān)鍵詞? ? 秈稻;核心種質(zhì);SSR標(biāo)記;聚類分析;云南省

中圖分類號(hào)? ? S511? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

遺傳基礎(chǔ)狹窄是近年來(lái)作物育種水平徘徊不前的主要原因之一。云南是世界稻種遺傳生態(tài)多樣性中心之一和中國(guó)優(yōu)異種質(zhì)的富集地區(qū)。目前，已開展了云南稻種初級(jí)與二級(jí)和三級(jí)核心種質(zhì)的取樣策略及技術(shù)體系、云南稻種資源多樣性、秈粳亞種及其六大生態(tài)群、變種分類等研究，建立了云南稻種資源核心種質(zhì)構(gòu)建體系[1]。

由于秈稻和粳稻之間較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系，秈、粳稻雜交往往會(huì)產(chǎn)生大量遺傳重組和分離類型。在核心種質(zhì)資源的構(gòu)建中一般以品種的表型性狀來(lái)劃分秈、粳稻，但只用表型性狀鑒定的秈粳稻往往會(huì)存在一定誤差。因此，有必要發(fā)展精確、可靠、快速、簡(jiǎn)便的鑒別方法[2]。SSR標(biāo)記是目前最常用的微衛(wèi)星標(biāo)記之一[3]。

本研究利用能區(qū)分秈、粳稻的10個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行秈粳鑒定，并與利用表型鑒定秈粳稻方法進(jìn)行比較研究，使云南稻核心種質(zhì)秈粳鑒定更為準(zhǔn)確，以期為有效利用種質(zhì)資源和進(jìn)行品種改良提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試材料

供試水稻材料：本研究從560份核心種質(zhì)中選出233份云南稻材料進(jìn)行SSR分子標(biāo)記，該材料來(lái)源于云南15個(gè)地區(qū)的種質(zhì)資源。包括231份經(jīng)表型性狀鑒定為秈稻的核心種質(zhì)水稻品種以及合系35和滇屯502，其中合系35為典型的粳稻品種，滇屯502為典型的秈稻品種。

供試SSR引物：選取由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的10對(duì)能鑒定水稻秈粳性的SSR引物RM130、RM165、RM1240、RM5305、RM7009、RM7337、RM7479、TC04、TC66、TC130，引物序列從網(wǎng)站（http：//www.gramene.org）獲得，由北京鼎國(guó)公司合成。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? DNA提取。經(jīng)表型性狀鑒定為秈稻的231份水稻材料以及合系35和滇屯502于幼苗期時(shí)掛牌取葉片，按CTAB法提取水稻DNA。

1.2.2? ? SSR反應(yīng)體系建立。PCR擴(kuò)增在PTC-200PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)混合物用20 μL石蠟油覆蓋，PCR結(jié)束后加2 μL雙染料進(jìn)行染色。

1.2.3? ? SSR反應(yīng)程序。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃下最后延伸5 min，4 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃的冰箱保存。

1.2.4? ? 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離與檢測(cè)。首先制膠，然后進(jìn)行電泳，對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行銀染。

1.3? ? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將銀染后的凝膠放到膠片觀察燈下讀帶。每對(duì)SSR引物作為一個(gè)位點(diǎn)，按在同一電泳水平上，有條帶的賦值為“1”，無(wú)條帶的為“0”，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為1/0 矩陣，利用NTSYSpc 2.10軟件處理SSR分型數(shù)據(jù)，將帶型數(shù)值1/0矩陣用該軟件轉(zhuǎn)換成品種間相似系數(shù)矩陣，用非加權(quán)平均法UPGMA進(jìn)行SAHN聚類分析，并通過(guò)NTSYSpc 2.10軟件得到供試材料的遺傳距離矩陣，計(jì)算品種之間的遺傳相似系數(shù)并繪制樹狀圖。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? SSR引物多態(tài)性

本研究利用10對(duì)SSR引物對(duì)來(lái)源15個(gè)地區(qū)的秈稻品種進(jìn)行了分析，10對(duì)SSR引物在這233份材料中共擴(kuò)增出28條多態(tài)性條帶，每對(duì)引物的等位基因數(shù)變幅為2～4個(gè)，平均每對(duì)引物等位基因數(shù)為2.8個(gè)。通過(guò)10對(duì)SSR引物對(duì)233份材料的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，10對(duì)引物中以檢測(cè)出2個(gè)等位基因位點(diǎn)數(shù)的引物最多，4個(gè)等位基因的次之。

2.2? ? SSR分子標(biāo)記聚類分析

用NTSYSpc 2.10軟件對(duì)233份供試材料進(jìn)行聚類分析，聚類分析顯示，這233個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)為0.35～1.00。所有的材料大致可分為2個(gè)大類群、4個(gè)亞群。此外，根據(jù)核心種質(zhì)地域來(lái)源的不同又分為了15個(gè)亞群。

以遺傳相似系數(shù)為原始數(shù)據(jù)，用UPGMA法對(duì)233個(gè)材料進(jìn)行聚類分析，以相似系數(shù)0.35為閾值，可將233個(gè)材料分為2個(gè)大類群，即秈稻與粳稻。以相似系數(shù)0.71為閾值，可將233個(gè)材料分為4個(gè)大類群，即秈稻、粳稻、偏秈稻、偏粳稻。在第1個(gè)類群中，68～92號(hào)的大部分品種基本與合系35聚為一類，說(shuō)明68～92號(hào)品種為粳稻品種，而由來(lái)源地來(lái)看，這些品種主要來(lái)自麗江和昭通這2個(gè)冷涼地區(qū)，所以這些秈稻品種雖在表型性狀上表現(xiàn)出了秈稻的特性，但從分子標(biāo)記的結(jié)果來(lái)看，它們屬于粳稻品種。因此，與表型性狀鑒定相比，SSR分子標(biāo)記鑒定能更準(zhǔn)確地揭示秈粳稻之間的遺傳差異。

根據(jù)10對(duì)SSR引物在233份供試材料中獲得的28個(gè)等位基因可知，粳型與秈型的遺傳分化系數(shù)最大，遺傳相似系數(shù)僅為0.047 619 0，遺傳差異最大，遺傳距離最遠(yuǎn);偏秈型與秈型的遺傳分化系數(shù)最小，遺傳距離最近;偏粳型與秈型、粳型與偏粳型、粳型與偏秈型的遺傳分化程度居中;偏粳型與偏秈型的遺傳分化程度較小。

3? ? 結(jié)論與討論

3.1? ? SSR分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)與多態(tài)性

本研究中，10對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出28條多態(tài)性條帶。SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與表型性狀鑒定基本吻合，但SSR分子標(biāo)記的鑒定更為準(zhǔn)確，能從分子水平上鑒定水稻秈、粳的分化，比表型性狀分類更為深入、細(xì)致。

3.2? ? SSR標(biāo)記鑒定與表型性狀鑒定

本試驗(yàn)中，各種質(zhì)表型性狀表現(xiàn)為秈，而基因型上表現(xiàn)為粳。表型性狀可能受單基因控制也可能受多基因控制，基因之間的連鎖、互作可能導(dǎo)致表型性狀的相關(guān)與嵌合等，種種因素加上環(huán)境對(duì)表型的飾變作用，最終導(dǎo)致表型與基因型之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜[4]。

本研究結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以彌補(bǔ)表型性狀鑒定水稻秈粳的分化的不足，但表型性狀不能反映育種工作中所產(chǎn)生的選擇和突變效應(yīng)[5-6]。因此，單用表型性狀還不能準(zhǔn)確把握某一材料的秈粳性，且對(duì)核心種質(zhì)的構(gòu)建會(huì)產(chǎn)生一定影響，SSR分子標(biāo)記可以檢測(cè)到材料之間在DNA水平上的遺傳差異。同時(shí)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)還可以把秈粳不清、來(lái)源不明的品種劃分到相應(yīng)的類群中，從而為更好地利用這些材料提供指導(dǎo)[7-8]。因此，通過(guò)表型性狀鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)相結(jié)合，則所得結(jié)果將更為完善。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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