血小板輸注無效患者體內(nèi)C1q-HLA抗體的臨床意義

李冬妹 王潔 敬媛媛 單小燕 賈延軍

除了血小板本身的質(zhì)量、臨床因素（血小板量過少、質(zhì)量低下、保存不當(dāng)?shù)龋⒒颊哂邪l(fā)熱感染、脾腫大、DIC及藥物作用等原因以外[1]，免疫學(xué)因素也是導(dǎo)致血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness, PTR）的主要原因[2]，這些因素主要是指血小板輸注無效患者體內(nèi)存在HLA（human leukocyte antigen）抗體和/或HPA（human platelet antigen）抗體。據(jù)文獻報道，反復(fù)輸注血小板的患者中有30%～70%會發(fā)生血小板輸注無效[3]，其中免疫學(xué)因素大約占到20%～30%[4,5]。

目前，對于發(fā)生了輸注無效且血小板抗體（包括HLA和HPA抗體）陽性的患者來說，需要對其進行交叉配血試驗以提供相合的血小板。但我們發(fā)現(xiàn)，有許多PTR患者，尤其是高致敏患者，往往難以找到相合的血小板。ELISA方法檢測出的抗體是HLA IgG總抗體，包括補體結(jié)合抗體和非補體結(jié)合抗體，補體結(jié)合抗體在細胞毒作用中是真正能固定補體并結(jié)合于血小板表面的破壞性抗體，而非補體結(jié)合抗體并不會導(dǎo)致血小板的破壞。有文獻報道，細胞毒抗體（即能與補體結(jié)合并產(chǎn)生細胞毒作用的抗體）在心臟移植和腎移植排斥中的作用比非補體結(jié)合抗體的作用更大[6-8]。另外，斯坦福大學(xué)的一篇文章也初步顯示，檢測能結(jié)合C1q補體成分的HLA抗體的單抗原磁珠（C1q-SAB）方法比檢測總IgG的單抗原磁珠（IgGSAB）方法能更好的檢測出臨床相關(guān)HLA抗體，其陽性患者通過交叉配血輸注血小板后能獲得更好的CCI值[9]。

因此，本項研究擬通過C1q-HLA抗體（即能結(jié)合補體成分C1q的HLA抗體）檢測技術(shù)把能固定補體、激活補體級聯(lián)反應(yīng)從而破壞血小板的HLA抗體檢測出來，并為這些患者提供特配血小板，觀察輸注后的臨床效果，分析C1q-HLA抗體在血小板輸注無效中的作用，評估C1q-HLA抗體檢測技術(shù)應(yīng)用在血小板輸注無效患者的檢測中是否有其可行性。

材料與方法

1 研究對象 收集臨床送檢的血小板輸注無效患者的血液樣本，這些患者都是因為血小板輸注無效而申請在血液中心進行血小板抗體檢測的，其中大部分患者都患有血液系統(tǒng)疾病，并且都有多次輸血歷史，包括血小板輸注。疾病包括急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、慢性髓性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）、急性淋巴性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴性白血?。╟hronic lymphoblastic leukemia，CLL）、多發(fā)性骨髓瘤（myelodysplastic syndrome，MDS）、再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）、原發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）等。

2 ELISA方法檢測血小板抗體 固相酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（Gen-Probe Incorporated,Waukesha, WI, USA）用于篩選患者血清中的HLA抗體（主要是抗HLA-I類抗體）和HPA抗體（血小板糖蛋白GPIb/IX、GPIIb/IIIa、GP Ia/IIa和GPIV），按照廠家說明書進行操作，結(jié)果用酶聯(lián)儀檢測（Thermo SCIENTIFIC, Hudson, NH, USA）。

3 LSA抗體和C1q抗體的檢測 利用單抗原磁珠（LABScreenTMSingle Antigen, One Lambda,Inc, Canoga Park, CA）和C1q抗體檢測試劑盒（C1qScreenTM, One Lambda, Inc, Canoga Park,CA）對ELISA方法檢測到的HLA抗體陽性的患者血清標(biāo)本進行進一步的檢測，其中LABScreenTM Single Antigen試劑盒可用于檢測患者血清中的HLA-I類和-II類抗體，C1qScreenTM試劑盒可用于檢測能結(jié)合補體成分C1q的HLA抗體。兩種試劑盒的操作方法相同，具體步驟按照廠家說明書進行操作。簡言之，取每個患者的待檢血清20 μL加入到96孔板內(nèi)，然后加入5 μL磁珠，室溫下避光孵育30 min，然后用緩沖液洗滌三次，加入100 μL用LPE標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，室溫避光保存30 min，洗滌后用LABScan 100流式細胞儀（One Lambda, Inc.）進行檢測，試驗結(jié)果用HLA Fusion 3.0軟件（One Lambda, Inc.）進行分析。

4 血小板交叉配血 利用單克隆抗體固相血小板抗體檢測試劑盒（MASPAT kit, Sanquin, Netherlands）進行血小板交叉配血，步驟如下：取4份供者血小板，稀釋后固定于96孔板內(nèi)，加入患者血清室溫孵育30 min；洗去未結(jié)合抗體，然后加入指示紅細胞，室溫孵育30 min后觀察結(jié)果。挑取配型相合的血小板提供給患者。分別收集患者輸注血小板前后的血小板計數(shù)值，計算1 h校正計數(shù)增加值（corrected count increment, CCI），其計算公式如下[10]：

5 統(tǒng)計學(xué)處理 樣本特征用描述性數(shù)據(jù)如頻率和百分率表示。Fisher精確檢驗用于比較分類變量。t檢驗用于分析連續(xù)變量。所有檢驗都應(yīng)用Graph-Pad Prism 5.0軟件完成（GraphPad, La Jolla, CA）。

結(jié) 果

1 40例血小板輸注無效患者的基本特征 研究共收集了40例經(jīng)ELISA方法檢測確認(rèn)為HLA抗體陽性的血小板輸注無效患者的血清樣本及其臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、血型、所患疾病種類及其C1q抗體狀態(tài)，入組患者包括13位男性和27位女性，其平均年齡為（46±22）歲，其中C1q-HLA抗體陽性患者的平均年齡為（48±22）歲。如表1所示，不同血型、不同疾病之間比較，其C1q-HLA抗體的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05，見表1。

表1 入組患者及C1q-HLA抗體陽性患者的ABO血型分布及疾病類型

2 HPA抗體陽性患者血清中HPA的特異性 選擇的40例患者，都是通過固相酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法確定為HLA或HPA抗體陽性的患者，其中有10例患者的血清中包含HPA抗體，占免疫性輸注無效的25%，這個結(jié)果與文獻報道基本一致[11]。本研究中檢測到HPA抗體主要是針對糖蛋白GP IIB/III的見表2。此外，有2例患者血清中包含兩種HPA抗體，分別是抗-GPIIb/IIIa和抗-Ib/IX抗體。

表2 HPA抗體陽性患者中抗血小板糖蛋白的特異性

3 40例血清樣本中LSA和C1q HLA抗體的狀態(tài) 我們分別采用One Lambda公司的LABScreen ? Single Antigen（LSA）試劑盒和C1qScreen?試劑盒對這40份血清進行了LSA抗體和C1q-HLA抗體檢測，測定了其群體反應(yīng)性抗體（PRA）的比例和抗體強度。結(jié)果顯示，40例血清樣本中有1例LSA陰性，在所有39例LSA陽性的血清樣本中，C1q-HLA抗體陽性的占28例，陰性的占11例。我們根據(jù)不同的LSA和C1q-HLA抗體狀態(tài)，比較了其群體反應(yīng)性抗體百分率（PRA%）和抗體的強度（Max MFI），結(jié)果如圖1A和1B所示，LSA抗體陽性的患者其PRA%和Max MFI明顯高于C1q-HLA抗體陽性的患者，說明用單抗原磁珠檢測到的HLA抗體中有相當(dāng)一部分抗體是非補體結(jié)合抗體，不是C1q-HLA抗體。

4 C1q-HLA抗體與交叉配血相合血小板輸注后CCI指數(shù) 本研究中40例HLA抗體陽性患者，只收集到了其中20人份的血小板輸注后CCI數(shù)據(jù)。根據(jù)血清中是否含有C1q-HLA抗體，我們比較了C1q-HLA抗體陽性和陰性患者輸注交叉配血相合血小板后的CCI數(shù)據(jù)（圖2），結(jié)果前者平均值為（13.11±9.07）×109，后者平均值為（6.68±3.86）×109。雖然C1q-HLA抗體陽性患者CCI值稍高于陰性患者，但兩者之間沒有顯著性差異。

圖1 血小板輸注無效患者血清中LSA抗體和C1q-HLA抗體的PRA%和抗體強度（Max MFI） （數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；LSA抗體陽性患者數(shù)=39，C1q-HLA抗體陽性患者數(shù)=28）

圖2 C1q-HLA抗體組和C1q-HLA抗體陰性組的血小板輸注后1小時CCI（數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差； C1q-HLA抗體陽性患者數(shù)=13；C1q-HLA抗體陰性患者數(shù)=7）

5 不同HLA抗體狀態(tài)對患者交叉配血找到相合血小板難易程度的影響 實驗室為HLA抗體陽性的患者進行交叉配血以尋找匹配的血小板，為了解不同HLA抗體狀態(tài)對患者交叉配血找到相合血小板難易程度的影響，我們統(tǒng)計了這40例患者歷次的交叉配血情況，根據(jù)不同的LSA和C1q-HLA抗體狀態(tài)，比較其相合供者百分比（是指交叉配血相合供者數(shù)占配血供者總數(shù)的百分比），其結(jié)果列于圖3中，C1q-HLA抗體陽性患者與陰性患者之間、以及C1q-HLA抗體陽性或陰性患者與LSA抗體陽性患者之間的相合供者百分率沒有相顯著性差異，說明抗體的狀態(tài)并不影響尋找相合血小板的難度。

討 論

圖3 LSA抗體組、C1q-HLA抗體組和C1q-HLA抗體陰性組的血小板相合供者百分率

在本研究中，我們分別利用ELISA方法和Luminex平臺檢測了血小板輸注無效患者血清中的HLA抗體和HPA抗體，并確定了這些HLA抗體是否能夠結(jié)合C1q補體。目的是為了分析C1q-HLA抗體在血小板輸注無效中的作用，評估C1q-HLA抗體是否與血小板的輸注療效更相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管這些HLA抗體中有一部分是可以結(jié)合補體成分C1q的抗體，但是其與非補體結(jié)合抗體相比，血小板輸注后的CCI值并沒有顯著性的差異，說明C1q-HLA抗體與血小板輸注療效可能不具有明確的相關(guān)性。這與以前的報道不一致，F(xiàn)ontaine MJ 等研究了13例高致敏的血小板輸注無效患者[9]，他們發(fā)現(xiàn)，與C1q不相合的血小板輸注相比，C1q相合的血小板輸注后可以得到更好的CCI值，因此他們認(rèn)為C1q-HLA抗體可能具有更高的臨床相關(guān)性。然而，一項TRAP研究顯示[12]，C1q結(jié)合的HLA-I類抗體的水平在血小板輸注無效患者和非輸注無效患者之間沒有顯著性差異，并且C1q結(jié)合抗體與CCI值之間也沒有明顯的相關(guān)性，這個研究的結(jié)果是與我們一致的。由此看出，C1q-HLA抗體的臨床相關(guān)性還需要得到更多的數(shù)據(jù)支持，是否需要為血小板輸注無效患者檢測C1q-HLA抗體也有待于進一步的臨床研究。

針對同種免疫性血小板輸注無效患者的管理一般采取兩種方法，一是從已經(jīng)進行HLA/HPA分型的機采血小板供者庫中選擇HLA/HPA相合的血小板供者；二是進行血小板交叉配血以選擇相合的血小板。交叉配血雖簡單易行，對于那些高致敏患者來說，往往難以找到相合的血小板。另外，即使找到了交叉配血相合的血小板，輸注后也有20%～30%的患者血小板計數(shù)值未達到預(yù)期值。因此，建立規(guī)模合適的血小板庫，為需要長期輸注血小板的患者提供HLA/HPA相合的血小板，是一種最佳的策略，因為這樣不僅可以提高血小板輸注無效患者的輸注效果，更重要的是，如果在開始時就輸注HLA/HPA相合的血小板，就能夠在很大程度上避免血小板輸注無效的發(fā)生，這將大大減少血小板的輸注量，在中國目前緊張的血液供應(yīng)形勢下節(jié)約寶貴的血小板資源。而建立血小板庫必須要考慮庫容量的大小，由于HLA系統(tǒng)和HPA系統(tǒng)、尤其是HLA系統(tǒng)具有復(fù)雜的多態(tài)性，只有了解了血小板輸注無效患者的HLA和HPA抗體的分布情況及其特異性，才能為建立規(guī)模合適的血小板庫提供依據(jù)。目前國內(nèi)已有多個血液中心建立了規(guī)模不等的血小板供者庫，其中包括廣州、上海、青島等，通過臨床應(yīng)用，取得了一定的社會效益。在2012年之前，上海市血小板供者庫就已經(jīng)接受了80人次的患者查詢，共有78名患者找到合適的供者，其中50名患者接受了單采血小板的同型（或配合型）輸注，47名輸注有效（24 h血小板回收率＞20%），其中更有15名患者同型輸注療效明顯，24 h回收率＞80%[13]。青島市血液中心采用PCR-SSO和PCR-SSP法對青島地區(qū)無償機采血小板捐獻者1800人進行HLA-I類（A、B位點）、HPA-1、-2、-3、-4、-5、-15基因分型，建立了已知HLA和HPA分型的無償機采血小板供者庫并用于解決血小板輸注無效患者的血小板輸注，1 800名的血小板供者庫可以使99%的患者在庫中找到至少1例HLA完全相合的供者[14]。本研究分析了北京地區(qū)血小板輸注無效患者體內(nèi)的相關(guān)抗體、確定了其特異性，了解了同種免疫性血小板輸注無效相關(guān)抗體的總體分布情況，這將為在北京地區(qū)構(gòu)建血小板庫提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

總之，本研究通過對同種免疫性血小板輸注無效患者補體結(jié)合和非補體結(jié)合HLA抗體及HPA抗體特異性的檢測，確定了北京地區(qū)血小板輸注無效患者體內(nèi)同種免疫性抗體的總體分布情況，為以后建立血小板庫提供了理論依據(jù)。初步研究結(jié)果顯示C1q-HLA抗體是否存在對于血小板輸注的療效并沒有直接的相關(guān)性，也不會增加患者尋找到相合血小板的難度。