運用1H-NMR技術(shù)研究補腎強督法對強直性脊柱炎代謝組學的分析＊

梁偉東，彭劍虹

（東莞市中醫(yī)院風濕科 東莞 523200）

強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是以青少年男性發(fā)病為主的自身免疫性疾病，以骶髂關(guān)節(jié)及脊柱疼痛、僵直為主要癥狀，逐漸出現(xiàn)脊柱畸形，最終可致殘疾，使人失去生活自理能力，增加家庭及社會負擔[1,2]。目前本病的治療目標是改善病情、延緩病程進展、提高病人生活質(zhì)量[3]。西醫(yī)治療分為傳統(tǒng)治療及生物制劑治療。傳統(tǒng)治療包括消炎止痛藥及免疫調(diào)節(jié)機，但療效一般，且副作用較大；生物制劑初期有一定療效，但由于費用昂貴，患者往往因為停藥及由于藥物本身的耐藥性出現(xiàn)病情反復。本病屬于中醫(yī)的“大僂”的范疇，臨床上往往伴隨怕冷、四肢冰冷、夢中流涎等一派督脈虛寒之象。清代名醫(yī)張錫純認為治療本病關(guān)鍵是補腎強督脈，并創(chuàng)造益督丸治療本病。通過大量的前期臨床驗證表明，我們發(fā)現(xiàn)益督丸不僅能有效緩解病人腰背疼痛情況，還能扶正固本，緩解強直性脊柱炎其他伴隨癥狀，提高生活質(zhì)量，提示治療本病療效確切。但由于益督丸成分多而復雜，其作用靶點是多元性，多途徑的，藥理機制還待進一步挖掘。因此，課題組基于代謝組學，運用1H-NMR技術(shù)從成分-靶點-通路預(yù)測益督丸代謝網(wǎng)絡(luò)，闡述中藥治療機制，實現(xiàn)中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化。

1 受試者和試劑

1.1 一般資料

強直性脊柱炎患者25例均來自于東莞市中醫(yī)院，（其中男14 例，占56%，女11 例，占44%，平均年齡31.64±4.23歲），本課題研究的整個過程中，所納入的25例病例中脫落了1例。此1例不作統(tǒng)計學分析。

1.2 納入標準

①臨床診斷標準參考強直性脊柱炎1984年美國風濕病學會修訂的紐約標準；②中醫(yī)證候標準參照《國家中醫(yī)藥管理“十一五”重點?？茀f(xié)作組大樓（強直性脊柱炎）診療方案》中關(guān)于腎虛督寒的中醫(yī)診斷標準。③年齡介于16-60歲。

1.3 排除標準

①妊娠或哺乳期婦女；②年齡不符合納入標準；③合并糖尿病、冠心病、腎功能不全、腫瘤及精神病等基礎(chǔ)疾病患者；④同時患有其他風濕免疫性關(guān)節(jié)炎，如白塞氏病、銀屑關(guān)節(jié)炎患者；⑤拒絕中藥治療及對中藥不耐受者。

1.4 剔除標準和脫落標準

治療過程未按時進行復診，自行停用中藥治療，或西醫(yī)治療方案轉(zhuǎn)換其他治療方案者；治療過程出現(xiàn)嚴重不良事件或反應(yīng)，導致病情加重，應(yīng)該退出臨床試驗。

1.5 病例分組

強直性脊柱炎組（A 組），25 例，抽取血清本，并進行證候積分及疾病活動度評估。固定西醫(yī)治療方案，接受中藥湯劑（益督丸）治療3個月，再次抽取血清，并完善證候積分及疾病活動度評估，我們定義為B 組。治療過程中由于1 例不能按時復診服用中藥，造成脫離。

1.6 益督丸組成

桑寄生15 g、續(xù)斷10 g、菟絲子15 g、狗脊15 g、茯苓12 g、澤瀉20 g、五味子6 g、砂仁10 g、杜仲15 g、懷牛膝12 g、鹿角霜15 g 等。水煎服，每日1 劑。藥物來源：東莞市中醫(yī)院。

1.7 試劑

無水磷酸二氫鈉（NaH2PO4）來自廣試有限公司，二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）來自粵僑有限公司，重水（D2O）來自杭普實驗器材有限公司。

1.8 實驗儀器

超導核磁共振波譜儀（Varian NMR System 500 MHz，美國瓦里安有限公司）；全自動生化分析儀BS-220（邁瑞Mindray）；微孔板振蕩器（無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司）；核磁管（寧杭普實驗器材有限公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

2 實驗和方法

2.1 樣品預(yù)處理

抽取患者血樣6 mL，于4℃，頻率為10000 Hz下離心10 min，吸取上層血清300 μL 至核磁管中，再吸取0.2 mol·L-1磷酸平衡液（pH=7.4）200 μL和重水50 μL，振蕩混勻。

2.2 NMR實驗

在25℃條件下，設(shè)置脈沖序列為Carr-Purcell-Mei boom-Gill，譜寬為10000 Hz，回波時間為1 ms，進行64 k采樣點數(shù)，64次循環(huán)次數(shù)，128次疊加次數(shù)核磁掃描。核磁信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為圖譜。

2.3 圖譜處理

使用專業(yè)軟件MestReNova（version 8.0.1）進行圖譜分析，把乳酸峰（δ1.33）作為化學位移參考峰，對所得圖譜進行相位、基線調(diào)整，自動積分，其區(qū)域規(guī)定為δ0.5-9.0，以0.005 ppm 為積分間隔。消除δ4.7-5.1區(qū)域水峰（積分值設(shè)為0），將所得積分數(shù)據(jù)歸一化處理，以Excel形式保存，進行下一步多元化統(tǒng)計。

2.4 數(shù)據(jù)處理

把上述積分數(shù)據(jù)導入SIMCA-P+14.0軟件（Umetrics，瑞典）進行PCA（主成分分析），PLS-DA（偏最小二乘法判別分析），OPLS-DA（正交偏最小二乘法判別分析）統(tǒng)計分析。作為評估模型驗證參數(shù)的R2和Q2，大于50%提示模型統(tǒng)計有效。OPLS-DA 結(jié)果使用得分圖（Score plot）和載荷圖（Loading plot）的形式表示。通過分析得分圖中組間積分差異化學位移，在載荷圖找出對這種差異貢獻值，并結(jié)合一維NMR 譜圖峰值變化，尋找相對應(yīng)的代謝產(chǎn)物。其他實驗數(shù)據(jù)使用軟件SPSS21.0 進行統(tǒng)計。計量資料使用±s表示，進行t檢驗。計數(shù)資料以%表示，進行X2檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 兩組治療前后中醫(yī)證候療效比較

我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療后兩組在腰痛、晨僵、夜間疼痛、怕冷乏力及四肢不溫等指標具有較大改善，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

3.2 兩組治療前后炎癥因子比較

患者治療后AS患者在枕墻距、指地距、強直性脊柱炎功能指數(shù)（BASFI）、強直性脊柱炎疾病活動性指數(shù)（BASDAI）均較大改善，具有統(tǒng)計意義（P＜0.05）（表2）。

3.3 兩組治療前后各測量值比較

患者治療后AS 患者在白介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-a（TNF-a）明顯減少，具有統(tǒng)計意義（P＜0.05）（表3）。

表1 兩組治療前后中醫(yī)證候療效比較

表2 兩組治療前后炎癥因子比較

表3 兩組治療前后各測量值比較

3.4 患者治療前后的1H-NMR測定分析

通過觀察AS 患者治療前1H-NMR 圖（圖1）譜差異，并運用Human Metabolome Database、Metlin 代謝組學數(shù)據(jù)庫并參考相關(guān)文獻[4-7]對圖譜中存在差異的代謝產(chǎn)物進行峰值歸屬標記，我們發(fā)現(xiàn)有10種存在差異代謝產(chǎn)物。對于差異較少的產(chǎn)物且不能確定是否存在統(tǒng)計意義的，需要進行多元系統(tǒng)分析。

圖1 AS組（紅線）和治療組（綠線）血清核磁圖譜。

3.5 患者治療前后的非監(jiān)督PCA分析

我們對患者治療前后進行非監(jiān)督PCA 分析。我們觀察到兩組分布情況能夠基本區(qū)分開，但仍有部分重疊（PC1 vs.PC2，R2=91.4%，Q2=80.8%）（圖2）。為了得到更有明顯的統(tǒng)計意義，方便尋找潛在中藥作用靶點，我們對數(shù)據(jù)進行進一步的PLS-DA 和OPLS-DA分析。

3.6 患者治療前后的1H-NMR 的PLS-DA 和OPLSDA分析

我們進一步進行PLS-DA 分析（R2x=81.3%，R2Y=81.2%，Q2(cum)=75.6%）（圖3），從得分圖發(fā)現(xiàn)兩組分布差異基本上能達到完全分開，但兩組個別樣本分布相對分散。為了找到與中藥作用靶點高度相關(guān)的代謝物，我們進行此基礎(chǔ)上OPLS-DA 分析來，提高模式識別方法的判定能力（R2x = 87.5%，R2Y = 91.3%，Q2(cum) = 72.3%）（圖4a），可以觀察到兩組的樣本無交叉和重疊，能夠在得分圖中提示完全分開，且兩組各自集中分布，表明其模式是有效。結(jié)合兩組OPLS-DA結(jié)果的載荷圖（圖4b），用權(quán)重系數(shù)（VIP）＞1，發(fā)現(xiàn)78個差異變量，其中篩選出13 個代謝物，并對治療前后的濃度變化情況的進行對比，確定代謝物變化趨勢?？梢缘玫酱x物如下：羥丁酸鹽、前列腺素D2、丙氨酸、精氨酸、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甜菜堿、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸及瓜氨酸。

圖2 AS組與治療組PCA分析

圖3 AS組（●）和治療組（●）PLS-DA分析圖

圖4 a AS組（●）和治療組（●）OPLS-DA得分圖

我們進一步采用建立coefficient-loading 相關(guān)圖的形式，運用back-scaling 的數(shù)據(jù)處理模式，得到的圖譜為NMR 圖譜的形狀[8]，從而可以清楚顯示兩組代謝物的變化趨勢。由于我們把治療前AS 組定義為原始觀察對象，相關(guān)圖中峰值向上代表在經(jīng)治療后代謝物的含量上升，而峰值向下則說明經(jīng)治療后患者代謝物的含量下降。從相關(guān)圖的顏色分布我們得知，顏色越紅表示貢獻率越大，表示本代謝無在兩組之間的差異越顯著；顏色越藍表示貢獻率越小，相應(yīng)的代謝物在兩組之間的差異不顯著。由于本研究中的統(tǒng)計計量數(shù)為49，根據(jù)相關(guān)系界值數(shù)表查得其相關(guān)系數(shù)臨界值|r|為0.456，如果代謝物的相關(guān)系數(shù)絕對值超過0.456，說明該代謝物具有統(tǒng)計意義。我們發(fā)現(xiàn)羥丁酸鹽、前列腺素D2、丙氨酸、精氨酸、甜菜堿、脯氨酸、谷氨酰胺及酪氨酸水平上升，而谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、馬尿酸鹽、葡萄糖、膽堿及瓜氨酸水平下降（圖5、表4）。

圖4 b AS組（●）和治療組（●）OPLS-DA散點圖

圖5 AS患者治療前后代謝產(chǎn)物差異對比圖

表4 兩組代謝產(chǎn)物的名稱及變化

3.7 潛在代謝通路分析

代謝物的變化可以反映整體代謝信息網(wǎng)絡(luò)，尋找異常代謝通路。把上述異常代謝物輸入MetaboAnalyst 4.0 進行分析，發(fā)現(xiàn)9 條重要的代謝通路，分別為酪氨酸通路，谷氨酰胺-谷氨酸通路，精氨酸通路，谷氨酸代謝通路，蘇氨酸-甘氨酸通路，精氨酸和脯氨酸通路，淀粉與葡萄糖通路，前列腺素D2 通路，馬尿酸鹽通路其中前7 條Pathway Impact ＞0.1，被列為最主要的代謝途徑（圖6）。根據(jù)實驗結(jié)果，結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫，涉及到的代謝通路包括糖代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝及氨基酸代謝，同時可能涉及人體神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)（圖7）。

4 討論

《內(nèi)經(jīng)》曰“督脈為病，脊強反折。腰痛不可以轉(zhuǎn)搖，急引陰卵，刺八與痛上，八在腰尻分間?！薄鞍螂鬃闾栔}，挾脊抵腰，是動則病脊痛，腰似折?！薄毒霸廊珪吩弧把鼮槟I之府，腎與膀胱為表里，故在經(jīng)則屬太陽，在臟則屬腎氣，而又為沖任督帶之要會。所以凡病腰痛者，多由真陰之不足，最宜以培補腎氣為主?！笨梢娧磁c督脈、膀胱經(jīng)功能失調(diào)有關(guān)。而督脈總督一身之陽經(jīng)，循行人體背部，六條陽經(jīng)都與督脈交會于大椎，督脈有調(diào)節(jié)陽經(jīng)氣血的作用。督脈虛寒，腎虛虧虛是強直性脊柱炎發(fā)病得關(guān)鍵。清代名醫(yī)張錫純認為補腎強督脈是治療本病的基礎(chǔ)大法，發(fā)明益督丸，用于本病治療，收到了良好臨床效果。從研究結(jié)果得知（表1、表2），不改變患者原有西醫(yī)治療方案的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用益督丸治療，可以有效緩解患者腰痛及晨僵等癥狀，提高患者脊柱活動度（枕墻距、指地距等），對于一些西醫(yī)難以緩解的癥狀，如怕冷乏力、四肢不溫及失眠等，均有明顯的改善，提示益督丸對本病的療效確切。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)益督丸能夠改變?nèi)梭w代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，現(xiàn)從如下7 條代謝途徑展開討論。

圖6 AS患者治療前后代謝網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖7 AS患者治療前后代謝通路分析圖

4.1 葡萄糖代謝、能量代謝異常與AS的關(guān)系

丙氨酸屬于非必需氨基酸，主要代謝通絡(luò)為參與丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，在生理條件下，丙氨酸在肝臟脫去氨基變成丙酮酸，后者參與糖異生過程生成葡萄糖，在肌肉有氧代謝中提供葡萄糖。丙氨酸的水平越低，提示外周肌肉組織對葡萄糖利用增加。本次研究發(fā)現(xiàn)，AS患者經(jīng)治療后丙氨酸，葡萄糖水平下降，說明益督丸可改善患者外周肌肉組織對葡萄糖利用。

我們對葡萄糖代謝進行進一步跟蹤，發(fā)現(xiàn)其參與的三羧循環(huán)的α-酮戊二酸、谷氨酸和羥丁酸鹽水平異常。有氧條件下，葡萄糖經(jīng)糖酵解生成丙酮酸，進入三羧循環(huán)，后者經(jīng)異構(gòu)并氧化脫羧生成α-酮戊二酸，在有氧代謝不充分情況下，α-酮戊二酸可以在體內(nèi)與氨作用，生成谷氨酸。羥丁酸是酮體的主要組成成分，占酮體總量的70%，提示存在糖及脂類代謝障礙，氧化分解后成為羥丁酸鹽和水。經(jīng)治療后α-酮戊二酸、谷氨酸水平下降，羥丁酸鹽水平上升，提示中藥治療可以有效改善患者三羧循環(huán)，促進有氧代謝，為人體提高能量，改善怕冷、四肢不溫及疲倦乏力等狀態(tài)。因此我們認為益督丸具有改善患者能量代謝網(wǎng)絡(luò)通路的能力。

4.2 甘氨酸代謝通絡(luò)與AS的關(guān)系

膽堿是一種強有機堿，是卵磷脂的組成成分，與脂肪酸以磷脂形結(jié)合，在蘇氨酸作用下，促進脂肪酸氧化分解，并在肝臟和腎臟中提供甲基與甜菜堿，合成甘氨酸。陳麗虹等[9]研究表明，甘氨酸具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)作用，具有抑制炎癥細胞因子的轉(zhuǎn)錄，使炎癥因子及氧自由基合成下降。我們研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后患者甜菜堿、膽堿水平上升，甘氨酸水平下降，提示甘氨酸代謝通路得到改善，同時我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后患者IL-6、TNF-a 等炎癥因子下降，TNF-a 是最重要的炎癥因子，引發(fā)人體的炎癥風暴，通過誘導如IL-6 等多種炎癥因子上調(diào)表達，作用血管內(nèi)皮細胞及炎癥細胞，幾何級放大炎癥反應(yīng)和毒性作用，造成組織細胞損害[10-12]，我們研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后患者上述炎癥指標下降，提示益督丸具有降低炎癥反應(yīng)，可能與甘氨酸代謝通絡(luò)有關(guān)。

4.3 氨基酸代謝異常與AS的關(guān)系

人體中含有多種神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，如腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等，酪氨酸是這些物質(zhì)合成的基礎(chǔ)[13]。中醫(yī)認為腎為先天之本，先天元氣所藏之處，而脊柱乃一身之骨主，督脈循脊入骶、貫脊屬腎，督脈為腎所主。腎主溫煦、藏精功能與“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)有內(nèi)在聯(lián)系。益督丸具有溫補命門強督之效，可以有效改善怕冷、四末不溫及睡眠障礙，且本研究提示經(jīng)治療后患者酪氨酸水平上升，提示其作用靶點可能與對神經(jīng)-內(nèi)分泌有調(diào)節(jié)有關(guān)，需要后期研究進一步證實。

AS 與人體白細胞抗原HLA-B27 編碼基因高度相關(guān)。HLA-B27 基因?qū)儆冖裥蚆HC 基因，廣泛分布于各組織有核細胞表面的肽結(jié)合性異二聚體，有1 條重鏈和2 個b2 微球蛋白，并與含精氨酸的9 肽相結(jié)合，CD8+細胞毒T 細胞識別其肽鏈，啟動免疫反應(yīng)[14]。提示精氨酸可能參與HLA-B27 表達，增強細胞免疫反應(yīng)。另有研究表明，精氨酸代謝，與細胞凋亡相關(guān)，可能會導致哮喘患者線粒體呼吸鏈損傷，臨床上表現(xiàn)乏力倦怠、氣促等陽氣虛證表現(xiàn)[15]，與本研究結(jié)果一致。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后，患者精氨酸水平上升，提示益督丸可能改善患者免疫代謝及改善患者“陽氣虛”狀態(tài)。

前列腺素D2 是最強效的內(nèi)源性睡眠促進物質(zhì)，可誘導生理性睡眠[16]。前列腺素D2 具有潛在的鎮(zhèn)靜催眠作用，未來可能成為睡眠得良好調(diào)節(jié)劑。臨床上發(fā)現(xiàn)AS 患者常因熬夜、失眠等因素導致病情加重。改善睡眠質(zhì)量，對強直性脊柱炎有較大的幫助。同時前列腺素D2 具有減少炎癥因子對分泌而起到抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱的作用，對強直性脊柱炎腰痛具有明顯緩解作用[17]。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后患者前列腺素D2水平上升，提示益督丸可能潛在有調(diào)整睡眠、消炎止痛作用。

脯氨酸促進牙釉質(zhì)修復，使得牙齒更加堅固并富有彈。脯氨酸是生產(chǎn)羥脯氨酸和羥賴氨酸所需要的，膠原有助于愈合軟骨，并給關(guān)節(jié)和脊椎提供緩沖。中醫(yī)認為，腎主骨，藏精而生髓。病理情況下，督虛元氣失藏，不能生髓，“髓”功能異常，臨床表現(xiàn)為腰痛，晨僵，脊柱活動指數(shù)下降。本研究發(fā)現(xiàn)AS 患者經(jīng)治療后水平上升，提示益督丸改善脯氨酸代謝通路，可能具有改善膠原蛋白、軟骨合成，起到緩解骶髂關(guān)節(jié)炎癥。

4.4 腸道功能紊亂與AS的關(guān)系

谷氨酸被谷氨酰胺合成酶轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，谷氨酰胺再被轉(zhuǎn)運回合成谷氨酸，參與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)。在腸絨毛上部成熟線粒體，谷氨酰胺經(jīng)脫氨基，生產(chǎn)瓜氨酸和一氧化氮，后者可刺激tj 蛋白的表達，此過程提供能量[18]，谷氨酰胺可促進腸道細胞ATP生成，是腸內(nèi)能量生成的最大貢獻者，并改善膿毒癥患者腸粘膜屏障功能[19]?；颊哐芯堪l(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后AS患者谷氨酸、瓜氨酸水平下降，谷氨酰胺水平上升，提示谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)得到改善，促進腸道細胞能量代謝。馬尿酸鹽為腸道微生物將飲食中的芳香族化合物代謝形成，經(jīng)治療后馬尿酸水平下降，提示加速腸道菌群代謝。益督丸組方中，非一味重視溫陽，我們同時重視后天脾胃功能，方中重要茯苓、澤瀉健脾利濕，砂仁交會中宮，改善患者脾胃功能，而中醫(yī)的脾胃功能可能與腸道微生態(tài)息息相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后患者谷氨酸-谷氨酰胺代謝通路及馬尿酸鹽代謝通路得到改善，我們推測可能潛在具有改善腸道菌群的作用。

綜上所述，本研究使用1H-NMR 技術(shù)的代謝組學方法，分析使用益督丸治療AS 患者共篩選出13 個代謝產(chǎn)物、9個代謝途徑，涉及糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)等多條途徑，且經(jīng)治療后患者證候評分及炎癥指標均得到改善，提示益督丸對強直性脊柱炎的治療靶點是具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的特點，代謝組學對方劑的研究具有一定的意義，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化探索的重要途經(jīng)，同時我們也具有一定局限性，仍需要后期完善免疫水平及組織病理檢查，來驗證本研究結(jié)論。