冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究的系統(tǒng)綜述＊

傅夢薇，劉詠梅，陳恒文，周思遠，劉蘭椿，李洪崢，何浩強，王 階＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦侵腹跔顒用}粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，目前已成為全球亟待解決的重大衛(wèi)生問題，屬中醫(yī)“胸痹心痛”范疇[1]。病證結(jié)合是中西醫(yī)結(jié)合臨床的重要研究方法，自20 世紀(jì)70年代以來，我國開展了冠心病的中醫(yī)證候研究，確立了證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)的中藥臨床藥效研究及新藥試驗提供了支撐。陳可冀院士認(rèn)為血瘀是冠心病的主要病機，并提出運用中醫(yī)藥活血化瘀治法治療冠心病[2]。冠脈造影或冠狀動脈血管成像等檢查手段證實冠心病患者均存在冠狀動脈狹窄，根據(jù)中醫(yī)證候積分可發(fā)現(xiàn)均符合血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，故普遍認(rèn)為血瘀證是冠狀動脈狹窄的病理基礎(chǔ)[3]。近年來，眾多學(xué)者聚焦于冠心病血瘀證的證候客觀化臨床研究[4]，尤其是微觀層面的基因組學(xué)與證候之間的關(guān)聯(lián)，極大地推進了證候的客觀化研究，如圍繞miRNA 進行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究就被認(rèn)為是21 世紀(jì)生物學(xué)領(lǐng)域的重大進展。與基因組學(xué)研究相比，蛋白質(zhì)組學(xué)研究主體為生物大分子并作為疾病診斷標(biāo)記物，而非DNA和RNA。目前心血管領(lǐng)域?qū)谛牟⊙鲎C蛋白組學(xué)的研究仍處于起步階段，多著眼于鑒定其蛋白組學(xué)特點、中醫(yī)藥干預(yù)的療效監(jiān)測等，研究方法多種多樣，主要有：①冠心病血瘀證患者與健康人對照；②冠心病血瘀證與非血瘀證患者對照；③冠心病血瘀證、非血瘀證患者與健康人三者對照。由于研究方法存在差異，研究者對冠心病血瘀證存在的相關(guān)蛋白與涉及的病理過程等方面仍存在爭議。為此，本研究對冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法及其結(jié)果進行評價分析，以期為未來研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索策略

計算機檢索中國知識資源總庫（CNKI）、中國學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫（Wanfang Data）、Cochrane、Medline。檢索范圍均為建庫-2020年2月公開發(fā)表的與冠心病血瘀證蛋白組學(xué)相關(guān)的臨床試驗或基礎(chǔ)研究。采用專業(yè)檢索，根據(jù)不同數(shù)據(jù)庫制定具體檢索式（詳見附錄）。中文檢索詞：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、冠心病、血瘀、心脈瘀阻、胸痹、蛋白；英文檢索詞：Coronary artery disease，Coronary atherosclerosis disease，Blood Stasis，Proteomics。

1.2 文獻納入標(biāo)準(zhǔn)

①文章類型：采用隨機對照設(shè)計的中英文研究，無論是否采用盲法或分配隱藏；②受試者：滿足2016年中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會制定的《冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》的患者，年齡構(gòu)成、性別比例、病程不限；③主要結(jié)局：差異蛋白質(zhì)的種類及表達水平。

1.3 文獻排除標(biāo)準(zhǔn)

①綜述或述評；②動物實驗；③重復(fù)發(fā)表的文獻；④血瘀證合并其他證候；⑤未采取蛋白組學(xué)方法；⑥會議論文。

1.4 文獻納入篩選

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入NoteExpress3.2.0 進行查重管理。閱讀文章標(biāo)題和摘要，剔除主題不相關(guān)文獻，然后下載并閱讀全文，嚴(yán)格根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)進一步篩選。

1.5 資料提取

由2名評價員（傅夢薇、周思遠）獨立按照事先設(shè)計的表格提取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻資料，當(dāng)意見不一致時通過討論協(xié)商或向第3位研究員（劉蘭椿）咨詢解決。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索及篩選結(jié)果

初步檢索獲得文獻259 篇，其中包括中國知網(wǎng)的140 篇、萬方數(shù)據(jù)庫的91 篇、Medline 數(shù)據(jù)庫的12 篇、Cochrane數(shù)據(jù)庫的16篇，利用NoteExpress 查重剔除重復(fù)33 篇，剩余文獻226 篇。對剩余文獻閱讀文題和摘要初篩，刪除111 篇與研究內(nèi)容不符的文獻，剩余115篇文獻進行閱讀全文復(fù)篩。全文復(fù)篩后排除101篇文獻，其中綜述或述評13 篇、動物實驗9 篇、臨床資料重復(fù)15 篇、合并其他證候35 篇、未采取蛋白組學(xué)技術(shù)25篇、會議論文4 篇，最終納入定性分析的文獻數(shù)為14篇，均為原始研究（圖1）。

2.2 文獻基本特征

根據(jù)納入研究的16篇文獻顯示，目前尋找差異蛋白的冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法有以下3種：①將冠心病血瘀證患者與健康人進行對照；②將冠心病血瘀證患者與冠心病非血瘀證患者進行對照；③將冠心病血瘀證患者、冠心病非血瘀證患者、健康人三者進行對照。從樣本大小、檢測內(nèi)容、技術(shù)手段、差異蛋白質(zhì)點及表達水平、差異蛋白質(zhì)介導(dǎo)的生物學(xué)過程等進行信息提取與分析（表1）。

表1 納入蛋白組學(xué)研究的文獻基本特征

續(xù)表1

圖1 文獻檢索流程圖

2.3 涉及病理機制

從納入文獻的蛋白組學(xué)研究結(jié)果來看，冠心病血瘀證可能涉及炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)異常與脂代謝紊亂等病理機制（表2）。

表2 涉及病理機制代謝途徑的主要差異蛋白種類及表達水平

2.3.1 炎癥反應(yīng)

hs-CRP、Haptoglobin、α1-Antitrypsin、Fibrinogen、Vitamin D-Binding Protein 與sICAM-1 是冠心病血瘀證最關(guān)鍵的表達水平升高的6種差異蛋白（圖2）。

hs-CRP 是反映炎癥的重要指標(biāo)，可上調(diào)粘附因子表達并促進炎癥因子分泌，黏附因子sICAM-1 的表達水平可反映粥樣斑塊的局部量；炎癥因子通過細(xì)胞因子作用損傷血管內(nèi)皮，使NO 失活分解并釋放大量的自由基，進一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管痙攣、脂質(zhì)代謝失常。此外，CRP 的升高促進可巨噬細(xì)胞攝取LDL，將其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，可同樣增加粥樣斑塊。以上過程共同促進動脈粥樣硬化的形成，最終造成心肌缺血、缺氧，心肌細(xì)胞損傷，引發(fā)冠心病的產(chǎn)生。因此，CRP 與sICAM-1 聯(lián)合在增加淋巴細(xì)胞遷移至病灶的過程中發(fā)揮作用，是與動脈粥樣硬化發(fā)生、演變和進展重要的促炎因子[19-21]。Haptoglobin 作為一種急性時相反應(yīng)蛋白，具有抗氧化、抗菌等作用，表達水平與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[22]。α1-Antitrypsin 與Fibrinogen 也是急性時相反應(yīng)蛋白，具有抗炎、抗凋亡的機體保護作用，兩者表達量的升高說明炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Vitamin D Binding Protein 是肝臟實質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，可結(jié)合Vitamin D 和肌動蛋白，在炎癥反應(yīng)中起到一定作用[23]。Transthyretin 含量與炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，可能是機體代謝失常的潛在標(biāo)志物[24]。這些與炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達水平差異反映出冠心病血瘀證存在炎癥反應(yīng)。

2.3.2 凝血系統(tǒng)異常

現(xiàn)代研究認(rèn)為，血瘀證證候的形成可能與凝血-纖溶系統(tǒng)異常導(dǎo)致的血液高凝狀態(tài)、血栓形成等密切相關(guān)，故在冠心病血瘀證的蛋白組學(xué)研究中，凝血-纖溶系統(tǒng)相關(guān)蛋白是比較重要的研究方向[25-26]。血小板微粒PMPs、血小板表面膜糖蛋白CD62p、血小板激活復(fù)合物PAC-1、白細(xì)胞分化抗原CD40L、CD41、GMP-140、Actinγ、PAI-1、t-PA 等是冠心病血瘀證與凝血過程關(guān)系密切的主要差異蛋白（圖3）。

圖2 炎癥反應(yīng)差異蛋白作用途徑

圖3 凝血-纖溶系統(tǒng)差異蛋白作用途徑

PMPs 具有黏附、聚集血小板及促炎癥反應(yīng)的作用；PMPs 表達CD62p 后可使血小板活化，從而形成血栓，研究表明CD62p 濃度與血瘀證積分呈顯著正相關(guān)[27]；PAC-1 與Fg 結(jié)合后協(xié)助血小板聚集，進一步促進凝血過程；CD40L 主要作用是促進白細(xì)胞聚集，還可結(jié)合其受體CD40 從而激活血小板，進而推動促凝血過程；CD41和β3以結(jié)合后形成αⅡb-Ⅲa，是血小板最重要的膜受體，故CD41 表達水平可反映出血小板聚集程度；GMP-140 在血小板活化時從α顆粒轉(zhuǎn)移到膜上，標(biāo)志著血小板活化，故在血栓性疾病發(fā)病過程中顯著升高；Actinγ是血小板骨架蛋白的組成部分，有推測認(rèn)為其在冠心病血瘀證患者血液中上調(diào)是為了在血小板完全活化前為后續(xù)血小板分泌、變形、移動做準(zhǔn)備；PAI-1 是PA 的主要生理抑制物，能滅活t-PA活性，阻斷纖溶酶原激活，從而促進凝血。以上8種差異蛋白均與血小板參與凝血反應(yīng)呈正相關(guān)，可通過影響血小板形態(tài)變化、血小板間、血管內(nèi)皮細(xì)胞與血小板的粘附遷移來起到促凝血作用，其表達水平的上調(diào)標(biāo)志著凝血過程處在亢進階段。而t-PA 作為纖溶系統(tǒng)標(biāo)志物，可反應(yīng)血液中纖溶活性大小，纖溶系統(tǒng)可防止體內(nèi)血栓形成，與凝血系統(tǒng)處在平衡狀態(tài)已維持機體正常狀態(tài)，故t-PA的表達水平與凝血活性呈負(fù)相關(guān)。在冠心病血瘀證患者血液中出現(xiàn)明顯的t-PA 表達下調(diào)，代表其纖溶活性下降，凝血活性增加，從而促進血管內(nèi)凝血和血栓形成。

2.3.3 脂代謝紊亂

在納入的14項研究中，發(fā)現(xiàn)與脂代謝相關(guān)的差異蛋 白 主 要 有ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ（Clusterin）與APO-B1004種（圖4）。

ApoA-I 是HDL 的主要成分，其表達水平可代表HDL 的含量；ApoA-IV 可介導(dǎo)肝細(xì)胞結(jié)合HDL，利于膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)外排；ApoJ（Clusterin）存在于HDL 和VHDL 中，同樣可促進膽固醇外流，協(xié)同HDL 起到抗動脈粥樣硬化的作用。APO-B1005具有維持LDL 結(jié)構(gòu)、識別LDL 受體和正向轉(zhuǎn)運Cho l等作用，故其表達水平與LDL呈正相關(guān)。故ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ 的表達水平與冠心病血瘀證嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，APO-B1005 表達水平與其呈正相關(guān)。此外，臨床常用APOA1/APOB100 作為冠心病防御因子（HDL）/危險因子（LDL）之比，比單獨測定APOA1 和APOB100 更有意義，當(dāng)其比值＜1 時可認(rèn)為是冠心病的危險指標(biāo)[28]。冠心病血瘀證患者的前三項差異蛋白表達水平均比健康人降低，且APOA1/APOB100比值也已下降至＜1的水平，可見冠心病血瘀證存在脂代謝紊亂，這可能與冠心病動脈粥樣硬化過程相關(guān)，與血瘀證的證候特異性還需進一步研究證實。

圖4 脂代謝過程差異蛋白作用途徑

2.3.4 其他生物學(xué)過程

除上述差異蛋白外，在冠心病血瘀證中上調(diào)的其他蛋白還有Serum albumin、Retinol-blinding protein4等。Serum albumin 在人體內(nèi)血液內(nèi)含量豐富，參與多種代謝過程，心肌缺血發(fā)作時部分Albumin 的N-末端受損或被銅占據(jù)，可以做為急性心肌缺血的一種生化標(biāo)志物。目前關(guān)于Retinol-blinding protein4 的國內(nèi)外研究較少，認(rèn)為其血清水平與動脈粥樣硬化呈正相關(guān)，具體作用機制尚不清晰[29]。故冠心病血瘀證的可能病理機制還包括心肌缺血、動脈粥樣硬化等。

2.4 中醫(yī)藥干預(yù)影響相關(guān)蛋白的表達

方證結(jié)合是中醫(yī)藥療法的顯著特點，將蛋白組學(xué)研究技術(shù)和策略結(jié)合方證對應(yīng)思想，不僅能觀察中藥治療冠心病血瘀證前后相關(guān)蛋白的表達差異，還能探索某些藥物的作用靶點與作用機制，從而為中藥療效提供證據(jù)支持[30]。

治療冠心病血瘀證常采用活血化瘀、溫陽行氣等治法。研究顯示，用于治療胸痹、心痛等心系疾病的部分中藥或中藥有效成分干預(yù)冠心病血瘀證后在蛋白組學(xué)方面顯示出一定的影響。李榮軍等[31]用丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證，在治療前后運用標(biāo)記免疫熒光抗體技術(shù)對進行血小板膜糖蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)治療后反映血小板黏附聚集作用的血小板膜糖蛋白CD63 和PAC-1 表達水平明顯上調(diào)、CD42b表達水平明顯下調(diào)，表明丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液可降低冠心病血瘀證患者的血小板活化功能，抑制凝血過程，有效緩解血瘀證癥狀，與丹參的活血化瘀作用不謀而合。王軍[32]等用谷紅注射液治療冠心病血瘀證患者12天后，采用免疫比濁法檢測血漿差異蛋白，發(fā)現(xiàn)反映動脈粥樣硬化與炎癥反應(yīng)的CD62p和hs-CRP 均顯著下降，表明谷紅注射液具有抗炎、抗血栓形成的功效，其中醫(yī)證候療效有效率高達90%，說明谷紅注射液在緩解血瘀證癥狀方面作用顯著，亦充分驗證了中藥紅花活血祛瘀、理氣通經(jīng)的功效。

3 討論

疾病的發(fā)生發(fā)展過程通常由于基因、外界刺激等因素的共同作用，且均伴有相關(guān)生物學(xué)過程特異蛋白質(zhì)表達差異。在冠心病蛋白組學(xué)方面，國內(nèi)外學(xué)者已有部分研究成果（如發(fā)現(xiàn)人類血漿HDL 有近50種獨立的蛋白成分）[33-35]，但在冠心病證具體證候蛋白組學(xué)方面仍處于初步階段。冠心病血瘀證作為冠心病最關(guān)鍵的中醫(yī)證型，尋找其病證結(jié)合診斷標(biāo)記物或預(yù)后因子是心血管領(lǐng)域的重要研究方向，運用蛋白組學(xué)技術(shù)方法來尋找冠心病血瘀證的蛋白標(biāo)記物可為其診斷、治療與預(yù)后起到不可估量的作用。

研究者匯總冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究進行篩選后納入14篇高質(zhì)量文獻。根據(jù)納入文獻顯示，目前尋找差異蛋白的冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法有以下3種：①冠心病血瘀證患者與健康人對照；②冠心病血瘀證與非血瘀證患者對照；③冠心病血瘀證、非血瘀證患者、健康人三者對照。檢測相關(guān)蛋白的技術(shù)方法包括雙向凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定、ELISA 法、免疫比濁法、發(fā)色底物法等，檢測到與冠心病血瘀證相關(guān)的差異蛋白種類繁多，涉及病理機制亦不盡相同。主要與炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血-纖溶系統(tǒng)異常等病理機制相關(guān)，與心肌損傷與動脈粥樣硬化或存在密切關(guān)系。

綜合分析上述研究結(jié)果，可見將冠心病血瘀證患者與健康人進行對照的研究方法目前最為常用，因其檢測手段方便易行，得到的差異蛋白種類較多，涉及的病理機制也最為豐富，包括炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血-纖溶系統(tǒng)異常、心肌損傷、動脈粥樣硬化等，但結(jié)果可能包含冠心病相關(guān)蛋白，而非血瘀證證型相關(guān)蛋白；對照冠心病血瘀證患者與非血瘀證患者的研究較少，檢測手段相對復(fù)雜，得到的差異蛋白種類雖多但主要涉及凝血-纖溶系統(tǒng)異常，可見其對血瘀證的特異度較高，不過可能會排除部分差異蛋白從而遺漏一些重要的病理過程，而且冠心病非血瘀證只是排除了血瘀證的診斷，可能包含其他中醫(yī)證型，不能排除得到的差異蛋白實則為其他證型（如氣虛證、痰濁證）的相關(guān)蛋白而非血瘀證，需進一步與其他證型相關(guān)蛋白進行對比；將冠心病血瘀證患者、冠心病非血瘀證患者、健康人進行對照的研究數(shù)量介于以上2種研究方法之間，其檢測手段主要為免疫比濁法、ELISA法等，得到的差異蛋白數(shù)量較少，涉及的病理機制主要為免疫反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血系統(tǒng)異常3種，既可避免第1種方法中證候特異性低的問題，也可通過健康對照來排除其他證型相關(guān)蛋白，故得到的結(jié)果相對準(zhǔn)確，代表性較高。

本研究創(chuàng)新性地匯總分析了近年來冠心病血瘀證蛋白組學(xué)的具體研究方法，并根據(jù)不同的研究方法探索其對差異蛋白結(jié)果及涉及病理機制的影響，有助于今后臨床研究者對于冠心病血瘀證的進一步探索，對于臨床診斷與治療具有指導(dǎo)意義。故在今后冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究中，推薦臨床科研人員根據(jù)研究內(nèi)容選擇合適的研究方法進行研究設(shè)計，應(yīng)更加著眼于涉及病理機制中重要信號通路內(nèi)關(guān)鍵蛋白的表達，從而精準(zhǔn)服務(wù)于中西醫(yī)病證結(jié)合的診斷、治療與預(yù)后過程。