融合表達乙醇酸氧化酶和過氧化氫酶轉基因馬鈴薯的表型分析

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)，茄科一年生草本植物，是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，我國馬鈴薯種植面積居世界首位[1]。目前馬鈴薯的應用研究主要集中于糧食加工、抗病、脫毒、品質等方面，由于世界人口增長、全球財富增加和可耕地減少，馬鈴薯的生物工程改良顯得越來越重要[2,3]。

光合作用是物質生產與產量形成的生理基礎[4]，而光呼吸是所有進行光合作用碳固定的細胞在光照下發(fā)生的一個生化過程，此過程消耗氧氣，生成二氧化碳，是光合作用損耗能量的一個副反應[5,6]。預測表明，在未來大氣中的CO2濃度達到最高水平時，仍可以減少植物光呼吸使光合速率上調12%～55%[7,8]。所以，通過構建光呼吸支路來提高光合效率和產量的研究逐漸引起重視[9,10]。目前，通過在植物葉綠體和過氧化物酶體內引入外源酶在擬南芥、水稻等植物中共建立了4條光呼吸支路，部分支路起到了使植物的光呼吸減少，光合作用和生物量產量增加等積極效果[11-14]。

乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，縮寫GLO)存在于過氧化氫酶體，是參與光呼吸過程中的關鍵酶。在光呼吸代謝支路中，其通常被葉綠體定位信號肽引入葉綠體表達，分解光呼吸的第一個產物乙醇酸，生成乙醛酸(Glyoxylate)與過氧化氫(H2O2)。過氧化氫酶(Catalase，縮寫CAT)是分解H2O2避免其損害細胞的一種保護酶，Maier等[12]使用大腸桿菌的過氧化氫酶清除GLO分解乙醇酸產生的H2O2，在葉綠體中成功構建了光呼吸支路；Shen等[14]也在水稻葉綠體構建光呼吸支路時使用水稻的過氧化氫酶OsCAT2清除H2O2，獲得了良好的效果。

本研究在馬鈴薯葉綠體中構建光呼吸支路，為了協(xié)調GLO和CAT的表達，將2個酶融合在1個表達盒中表達。融合表達的2個酶彼此空間距離近，由1個啟動子啟動，能實現最高效率的協(xié)調表達。通過分析2種表型的馬鈴薯轉基因植株株高、有效葉面積、葉數、薯重等指標，有效評估了融合GLO、CAT分流乙醇酸，構建光呼吸支路的實際效益。

1 材料與方法

從水稻cDNA中擴增OsCAT2(AK 062174)和OsGLO3(AK 068638)編碼序列，通過1個編碼12個甘氨酸和3個絲氨酸(Gly 4 Ser)3接頭的DNA序列(5′GGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTTCT)，將2個基因的編碼區(qū)融合在一起，并在編碼的N端接入馬鈴薯rbcS葉綠體定位信號肽。將融合蛋白的表達盒接入到多基因轉化載體pBIA 13(華南農業(yè)大學彭新湘研究員課題組贈送)，通過煙草花葉病毒35 S啟動子啟動融合蛋白的表達。將重組后的質粒pBI-StTP-58 AA-CATGLO導入根癌農桿菌LBA 4404。

利用農桿菌介導法轉化馬鈴薯(鄂馬鈴薯3號)，以及通過DNA水平和蛋白水平表達分析，篩選得到4個轉基因株系，分別為B 11、B 14、B 17、B 27。轉基因植株在MS培養(yǎng)基上快速繁殖，當試管苗長至高2.5～3.0 cm，長1～2 cm新根時，移栽到泥炭土中種植。

同時在試管苗期，在MS培養(yǎng)基統(tǒng)一接種帶芽莖段，每株系接種4瓶，每瓶接種5個莖段，重復4次，30 d后統(tǒng)計瓶苗的高度。選取第一代種植收獲的大小均勻一致的薯塊作為種薯，每個株系種6盆，每盆1株，隨機排列。

在塊莖膨大后期，統(tǒng)計株高及有效葉數，取相同部位的功能葉片若干，使用萬深LA-S全能型植物圖像分析儀測定其葉形和葉面積。收獲時用稱重法測定產量，按薯重的大小，將其劃分為大、中、小薯3個標準：單株薯重大于20 g為大薯，10～20 g為中薯，小于10 g為小薯。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯GLO-CAT轉基因植株出現2種表型

在試管苗階段，轉基因株系B 14的試管苗高高于野生型5%，B 11降低0.4%；而株系B 17，B 27相對于野生型顯著降低，分別降低64%、39%(圖1 A)；對塊莖繁殖的第二代植株進行觀察分析，轉基因株系B 14的株高高于野生型3%，B 11降低9%；而株系B 17、B 27相對于野生型顯著降低，分別降低52%、38%(圖1 B，圖2 B)。

同時，轉基因株系B 17和B 27出現葉片扭曲變厚、葉色變深、小葉相連等現象；B 11、B 14葉形、葉色和小葉數無明顯差異(圖2 A)。株系B 11、B 14的葉面積與野生型相比分別增加29%和15%，而B 17、B 27分別減少25%和15%(圖1 C)。相對于野生型，株系B 11的有效葉數增加3%，B 14增加27%，而B 17和B 27顯著減少，分別減少31%和50%(圖1 D)。

轉基因株系B 14的株高、葉面積、有效葉數與野生型相比均有所提高，為第1種表型；而B 27和B 17株高，葉面積、有效葉數均有所降低，且出現葉片畸形的現象，為第2種表型。

2.2 GLO-CAT轉基因植株薯重的分布及形態(tài)改變

研究發(fā)現，轉基因株系B 11、B 14和B 17收獲的塊莖外部形態(tài)與野生型無明顯差異，而B 27的塊莖則出現畸形，表現為多個或大或小的塊莖發(fā)育在一起(圖3 A)。

對塊莖繁殖的第二代植株塊莖進行薯重分析，轉基因株系B 14的單株薯重相對于野生型顯著上升，增加23%，B 11降低19%；而B 17和B 27的單株薯重顯著下降，分別降低77%和76%(圖3 B)。大于20 g的塊莖比例(大薯率)，轉基因株系B 14為47%，野生型為20%，B 11與野生型接近，而B 27和B 17低于野生型，分別為13%和0%；10～20 g的塊莖比例(中薯率)，轉基因株系B 11為24%，野生型為13%，其余株系略低于野生型；小于10 g的塊莖比例(小薯率)，野生型為67%，株系B 11、B 14低于野生型，分別為57%和43%，而B 27、B 17高于野生型，分別為77%和89%(圖3 C)。

注：A為葉片；B為單株。圖2 塊莖繁殖的第二代植株的表型

注：A為試管苗高度分析(誤差線為標準誤，小寫字母表示0.05水平差異顯著性。下同)；B為塊莖繁殖的第二代植株高度分析；C為塊莖繁殖的第二代植株葉面積分析；D為塊莖繁殖的第二代植株有效葉數分析。圖1 GLO-CAT轉基因植株的形態(tài)指標

轉基因株系B 14的單株薯重、大薯率與野生型相比有增加的趨勢；而轉基因植株B 17和B 27薯重明顯降低，小薯偏多。

3 討 論

3.1 GLO-CAT融合表達對馬鈴薯代謝支路建立有積極的意義

目前，通過構建光呼吸支路來提高作物的生物量和產量，是極其有效的途徑之一。Kebeish等[11]在擬南芥葉綠體中引入大腸桿菌乙醇酸分解代謝途徑，成功減少了光呼吸代謝物通過過氧化物酶體和線粒體的通量，使其轉基因植物生長得更快，產生更多的根莖生物量；Shen等[14]通過在水稻葉綠體中引入3種水稻自源酶，將乙醇酸完全氧化成CO2，從而使轉基因水稻植株的光合效率、生物量產量和氮素含量顯著提高。在本研究中，轉基因株系B 14的葉形、葉色和小葉數與野生型無明顯差異，但葉面積、有效葉數、株高，單株薯重均明顯提高，與上述研究的結論相一致。說明在馬鈴薯葉綠體中引入GLO-CAT融合蛋白構建光呼吸代謝支路可行，通過分流乙醇酸、降低光呼吸，有效的增加了生物量和產量。

注：A為塊莖形態(tài)；B為塊莖單株鮮重；C為薯重分布(大薯≥20 g，20 g>中薯>10 g，小薯≥10 g)。圖3 塊莖繁殖的第二代植株塊莖形態(tài)及薯重

研究也發(fā)現了一種負的表型，轉基因株系B 27和B 17出現葉片變短、小葉數變少、葉色變深、葉片彎曲和薯重降低、小薯多等現象，這并不是光呼吸支路帶來的優(yōu)勢。有研究指出，馬鈴薯的品質和產量性狀是受復雜的微效多基因控制的數量性狀[15]。張先文[16]在水稻的轉基因研究中，綜合考慮了有效光合面積、株高等的變化。所以在馬鈴薯光呼吸代謝支路建立后，也應該考慮其他限制因子的變化。同時，GLO和CAT的適度表達，也是構建光呼吸支路的重要因素。如果GLO活性過高，CAT活性太低，不能將GLO分解乙醇酸產生的H2O2迅速的分解，將會影響其他代謝通路，抵消在葉綠體中分解釋放CO2產生的積極作用。本研究采用了融合蛋白的表達方式，有利于GLO和CAT的協(xié)調表達。本研究中，B 27和B 17這2個轉基因株系的葉片出現畸形的現象，可能的原因是融合蛋白的表達量過高，超過了CAT清理限度，葉綠體中的H2O2未能及時清除所致。

3.2 GLO-CAT融合表達對馬鈴薯生物量和產量的影響

光合作用主要發(fā)生在葉片中，通常葉片被稱為狹義的源，生長發(fā)育中的果實是光合產物積累的主要庫，生產中可以通過協(xié)調源庫之間的關系，達到源庫平衡以實現作物的高產[17]。張紹榮等[18]證明，馬鈴薯產量隨光合速率與單株葉面積之積的增大而增加，兩者呈正相關。李文婷分析指出，馬鈴薯葉片積累同化物越早、越多、時間越長，源的活性就越大，產量也越高[19]?？刀涮m等也提出，馬鈴薯的干物質含量、塊莖產量、塊莖數量和單株葉面積與光合速率呈正相關關系[20]。Nolke等[21]將大腸桿菌糖基脫氫酶(GlcDH)3個亞基(D、E、F)組成的重組蛋白(DEFp)導入馬鈴薯葉綠體，降低了光呼吸并導致莖葉生物量顯著增加，以此增加了光合速率和葉面積，使塊莖產量提高了2.3倍。說明了光呼吸代謝支路所造成的光合作用變化會直接影響作物產量。本研究中，轉基因株系B 14的株高、葉面積、有效葉數高于野生型，致使單株薯重、大薯率明顯提高，表明馬鈴薯因塊莖碳匯能力強而具有更大的轉基因優(yōu)勢。而B 27、B 17產量降低，可能由于單株的葉面積和有效葉數太少所致。

4 結 論

本研究通過融合表達乙醇酸氧化酶和過氧化氫酶，使轉基因株系B 14的單株薯重顯著高于野生型，株高、有效葉數和葉面積均有所提高，說明融合蛋白成功分流了乙醇酸，降低了光呼吸、提高了光合作用，生物量的增加可以表現在塊莖中。同時研究發(fā)現，由于葉片形狀、有效光合面積、有效葉數、株高等因子的變化，轉基因株系B 27和B 17出現塊莖畸形和薯重降低的現象。這一現象，在光呼吸代謝改造中不應忽視。