石油污染土中微生物的分離鑒定及降解特性

張娟　方祥位　劉漢龍　肖楊　張楠　曹小方

摘 要：為了為汽油污染土的微生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種，以LB培養(yǎng)基為基質(zhì)，從石油污染土中對(duì)汽油降解菌進(jìn)行了分離鑒定，以降油培養(yǎng)基為基質(zhì)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行汽油降解率的測(cè)定，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值及培養(yǎng)時(shí)間為參數(shù)對(duì)5種具有優(yōu)良汽油降解性能的菌株進(jìn)行單因素試驗(yàn)，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)后，以汽油降解率為響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，篩選出具有優(yōu)良降解性能的菌株，并確定了菌株降解汽油的最佳條件。結(jié)果表明：從石油污染土中分離出了9種具有汽油降解性能的菌株，其中，銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬具有優(yōu)良降解性能，這5種菌降解汽油的最優(yōu)條件為：銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌以及戈登氏菌的最佳培養(yǎng)溫度均為32 ℃，培養(yǎng)基pH值均為7.0，培養(yǎng)時(shí)間均為20 h，降油培養(yǎng)基中的汽油降解率分別為70.12%、76.42%、75.66%、77.50%和73.22%。

關(guān)鍵詞：石油污染土;汽油降解率;微生物;正交試驗(yàn);污染土修復(fù)

中圖分類(lèi)號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2096-6717（2020）01-0144-09

Abstract：In order to provide excellent strains for microbial remediation of gasoline-contaminated soil， the gasoline-degrading bacteria were isolated and identified from petroleum-contaminated soil using LB medium as the substrate， and the gasoline degradation rate was determined by using the oil-reducing medium as the substrate. Single factor test was carried out on five strains with excellent gasoline degradation performance at culture temperature， medium pH and culture time. Based on the single factor test results， three factors and three levels of orthogonal test were carried out to degrade with gasoline. Response surface analysis of test results with gasoline degradation rate response， screening of strains with excellent degradation performance and determining the optimal conditions for the degradation of gasoline by the strain. The results showed that nine strains with gasoline degradation properties were isolated from petroleum contaminated soil. Among which Pseudomonas aeruginosa， Pseudomonas， Pleurobacter， Bordetella and Goldenella had excellent degradation performance. The optimal conditions for determining the degradation of gasoline by these five kinds of bacteria as follows： The optimum culture temperature for Pseudomonas aeruginosa， Pseudomonas， Pleurobacter， Bordetella and Gordonia is 32℃，the pH of the medium is 7.0 and the culture time is 20 h. The degradation rates of gasoline in the oil-reducing medium are 70.12%， 76.42%， 75.66%， 77.50% and 73.22%， respectively.

Keywords：petroleum contaminated soil; gasoline degradation rate; microorganisms; orthogonal test; remediation of contaminated soil

石油是一種重要的能源，對(duì)經(jīng)濟(jì)和人民的生活水平都有很大的推動(dòng)作用，但在石油的開(kāi)采、加工以及運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)發(fā)生石油泄漏等問(wèn)題，資料表明，中國(guó)目前直接進(jìn)入到環(huán)境中的石油約有6×105 t，對(duì)土壤以及地下水造成嚴(yán)重污染。而汽油是用量最大的輕質(zhì)石油產(chǎn)品之一，汽油物質(zhì)進(jìn)入土壤后，主要從兩個(gè)方面對(duì)土壤的理化性質(zhì)造成影響：一是會(huì)影響土壤的通透性，使得土壤的結(jié)構(gòu)遭到破壞[1];二是汽油中的反應(yīng)基能夠與土壤中的無(wú)機(jī)氮和磷結(jié)合并限制土壤的硝化作用和脫磷酸作用，導(dǎo)致土壤中有機(jī)質(zhì)的碳氮比和碳磷比增大[2-4]。此外，汽油中的某些烴類(lèi)具有致病變、致癌甚至致畸形的作用，通過(guò)污染土進(jìn)入人體后，大量積累會(huì)嚴(yán)重危害到人體的健康[5]。因此，汽油污染土的治理和修復(fù)一直受到高度重視。

傳統(tǒng)的污染土治理方法有物理法和化學(xué)法，物理修復(fù)法主要有挖掘填埋法、電解法、洗滌法和氣體吹脫法等，但物理法所用的設(shè)備價(jià)格昂貴且可能破壞土壤的結(jié)構(gòu)和組分?；瘜W(xué)法主包括氧化劑氧化法、萃取法、熱分解法和光化學(xué)氧化法等，主要技術(shù)是利用化學(xué)浸出進(jìn)行除油，但此方法有可能對(duì)土體造成二次污染[6]。

生物修復(fù)法是一種綠色節(jié)能的方法，主要利用微生物及其他生物，將土壤中的有毒烴類(lèi)污染物降解為二氧化碳和水等無(wú)毒無(wú)害物質(zhì)，從而達(dá)到修復(fù)土壤的目的[7]。研究發(fā)現(xiàn)，有大量微生物能夠以石油中的烴類(lèi)作為唯一碳源進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)，微生物繁殖較快且比表面積大，因此，微生物修復(fù)污染土成為研究熱點(diǎn)[8]。目前，關(guān)于原油生物降解的研究主要集中在降解菌的篩選與鑒定[9-10]和生物降解機(jī)理[11-12]。閆志宇等[13]分離篩選出的菌株Bacillus subtilus L3能高效降解乙草胺。Guo等[14]從柴油污染的土壤中分離出兩種耐寒的石油烴降解菌株CHD1和CHD2。而汽油作為用量最大的石油提取物，對(duì)土壤造成的污染也最多。

已有研究表明，多種微生物都能對(duì)汽油烴類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行降解，但降解能力存在較大差異，因此，篩選降解汽油烴能力較強(qiáng)的菌種將會(huì)大大提高污染土的修復(fù)效率[15]。筆者通過(guò)從石油污染土中的微生物進(jìn)行分離鑒定以及通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)其降解汽油性能進(jìn)行測(cè)定和優(yōu)化，從而為汽油污染土的生物修復(fù)法提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

石油污染土來(lái)源于甘肅省成縣油氣管道轉(zhuǎn)換站，圖1所示為采集的土樣。主要取自表層以下2～15 cm處的污染土。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，配制200 mL，pH值調(diào)節(jié)為7.0，121 ℃滅菌20 min。

降油培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 0.50 g，KH2PO4 0.50 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.50 g，CaCl2 0.1 g，KCl 0.10 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，95號(hào)汽油4 g，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離與鑒定 稱(chēng)取石油污染土1.0 g放入到裝有9.0 mL的無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，在漩渦混合器中充分混勻，此時(shí)，溶液的稀釋度為10-1。利用梯度稀釋法對(duì)其繼續(xù)進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尩奶荻确謩e為10-2、10-3、10-4和10-5。用移液器從10-3、10-4和10-5這3個(gè)梯度中吸取20 μL的稀釋液，然后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將其接種到滅菌過(guò)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，涂布均勻后，將培養(yǎng)基放入32 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h[16-17]。培養(yǎng)完成后，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的單菌落接種到固體培養(yǎng)基中，重復(fù)多次。對(duì)菌種進(jìn)行純化后，分別進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，然后，將純化后的菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)。對(duì)每個(gè)菌種的DNA進(jìn)行提取[4，18-19]，利用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp條帶后，通過(guò)Sanger法進(jìn)行測(cè)序（擎科興業(yè)生物有限公司完成），將得到的序列利用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，從而確定菌株的類(lèi)別。

1.3.2 優(yōu)良降解菌株的篩選 將純化后的菌種在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，然后置于32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光度。吸取2 mL菌液，接種到200 mL的降油培養(yǎng)基內(nèi)，同樣在32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)2、4、6 d后，分別對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)的汽油含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算最終的汽油降解率。每個(gè)菌種做3組平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，從而對(duì)具有高效汽油降解能力的菌種進(jìn)行篩選。

1.3.3 汽油降解率的測(cè)定方法 將降解后的培養(yǎng)液放入離心機(jī)內(nèi)離心（轉(zhuǎn)速為100 r/min），20 min后提取上清液到新的滅菌過(guò)的錐形瓶?jī)?nèi)，每1 L上清液加入5 mL硫酸進(jìn)行酸化，然后加入40 mL的石油醚，將培養(yǎng)基內(nèi)殘余的汽油提取后對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，汽油降解率的計(jì)算式為[20]

1.3.4 菌種降解性能的測(cè)定

1）單因素試驗(yàn) 以LB培養(yǎng)基作為基質(zhì)，按照表1的3組實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h后，吸取20 μL菌液加入到降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后，對(duì)培養(yǎng)基中殘余汽油含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算并記錄汽油降解率。

2）在單因素試驗(yàn)的結(jié)果之上，對(duì)具有高效汽油降解能力的菌種進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，然后按照實(shí)驗(yàn)方案所列的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)[3，21]。利用Design-expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析以及最優(yōu)求解從而確定菌種降解汽油的最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽油降解菌的分離與鑒定

從汽油污染土中共分離出9株菌株，除了菌1和菌5形態(tài)特征較為明顯之外，其余在平板上的特征較為相似。將這9種菌株進(jìn)行編號(hào)為菌1～菌9，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，這9種菌上的特點(diǎn)見(jiàn)圖2。

對(duì)每種菌進(jìn)行分離純化后進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

利用NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果和己知序列進(jìn)行比對(duì)，分析其相似度，具體的鑒定結(jié)果為：菌1為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌2為假單胞菌屬（Pseudomonas），菌3為蒼白桿菌屬（Pleurobacter），菌4為博得特氏菌屬（Bordetella），菌5為戈登氏菌屬（Gordonia），菌6為同溫層芽孢桿菌（Bacillus），菌7為洛菲不動(dòng)桿菌（Acinetobacter），菌8為瓊氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii），菌9為暹羅芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），且相似率均大于99.9%。

2.2 優(yōu)良降解菌的篩選

對(duì)9株菌在降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后的汽油降解率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)表3可知，菌1、2、3、4、5的汽油降解率均超過(guò)60%，證明菌1、2、3、4、5降解汽油的能力較好，即銅綠假單胞菌、假單胞菌菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬對(duì)汽油有著較好的降解能力，且這5種菌無(wú)致病性，對(duì)環(huán)境無(wú)污染性。

2.3 菌株降解性能的測(cè)定

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)溫度對(duì)5種菌的汽油降解率的影響如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)溫度對(duì)5種菌的汽油降解率的影響趨勢(shì)大致相同，當(dāng)溫度小于35 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，汽油降解率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度大于35 ℃，汽油降解開(kāi)始下降，對(duì)于這5種菌來(lái)說(shuō)，35 ℃是較為合適的培養(yǎng)溫度。

培養(yǎng)基的pH值對(duì)5種菌的汽油降解率的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基pH值對(duì)5種菌的汽油降解率的影響趨勢(shì)大致相同，除了菌4在培養(yǎng)基pH為7.5時(shí)汽油降解率達(dá)到最大值，其余4種菌均在培養(yǎng)基pH為7時(shí)，汽油降解率達(dá)到最大值。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)5種菌汽油降解率的影響如圖5所示。由圖5可知，菌1在培養(yǎng)24 h時(shí)汽油降解率達(dá)到最大值，超過(guò)24 h后開(kāi)始下降，菌1在20、24 h的汽油降解率較為穩(wěn)定，但超過(guò)24 h后開(kāi)始下降，其余3種菌的汽油降解率均在培養(yǎng)20 h時(shí)達(dá)到最大值。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表4所示。

根據(jù)設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對(duì)每組的殘余汽油量進(jìn)行測(cè)定后對(duì)汽油降解率進(jìn)行計(jì)算，得到的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入軟件進(jìn)行分析，菌1～菌5的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表6～表10所示。

由表6～表10可知，這5個(gè)模型的F值分別為91.75、2 042.52、14 452.75、1 091.50以及79 620.51，且P值都小于0.000 1，說(shuō)明這5個(gè)模型的回歸方程極顯著，且這5個(gè)模型的失擬項(xiàng)都不顯著，說(shuō)明這5個(gè)模型都具有較好的模擬性，因此，這5個(gè)模型可以對(duì)石油降解率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

F值的大小反映出因素對(duì)實(shí)驗(yàn)因變量的影響程度，F(xiàn)值越大，表示因素對(duì)實(shí)驗(yàn)因變量的影響越顯著。由表6可知，對(duì)菌1的汽油降解率影響大小的因素依次是：因素A>因素C>因素B（培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)基pH值）;由表7可知，對(duì)菌2的汽油降解率的影響大小的因素依次為：因素B>因素C>因素A（培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度）;由表8可知，對(duì)菌3的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B（培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值）;由表9可知，對(duì)菌4的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素B>因素A>因素C（培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間）;由表10可知，對(duì)菌5的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B（培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值）。

利用Design-Expert 8.0.6軟件聯(lián)合求解這5個(gè)模型，得到結(jié)果為：菌1的最佳培養(yǎng)溫度為32.14 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時(shí)間為20.12 h，在此條件下算出的石油降解率為70.167 4%;菌2的最佳培養(yǎng)溫度為32.00 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.01，最佳的培養(yǎng)時(shí)間為20.07 h，在此條件下算出的汽油降解率為76.416 8%;菌3的最佳培養(yǎng)溫度為32.03 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時(shí)間為20.05 h，在此條件下算出的汽油降解率為75.676 6%;菌4的最佳培養(yǎng)溫度為31.84 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為6.97，最佳培養(yǎng)時(shí)間為19.84 h，在此條件下算出的汽油降解率為77.524 6%;菌5的最佳培養(yǎng)溫度為32.02 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳的培養(yǎng)時(shí)間為20.06 h，在此條件下算出的汽油降解率為73.250 6%。

由于這些最佳條件的參數(shù)在實(shí)際操作水平中很難實(shí)現(xiàn)，考慮到因素對(duì)于結(jié)果的影響大小，做以下調(diào)整：將菌1的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.1 ℃，培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為20 h，在此條件下再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為70.17%;將菌2的培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為76.42%;將菌3的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.0 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為75.66%;將菌4的培養(yǎng)溫度調(diào)整為31.8 ℃，培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為77.50%;將菌5的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為73.22%。

3 結(jié)論

1）從石油污染土中分離出的9種菌分別為：銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬、戈登氏菌屬、同溫層芽孢桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌以及暹羅芽孢桿菌，均對(duì)汽油具有一定的降解能力。

2）篩選出的高效汽油降解能力的5種菌為銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬，5種菌的汽油降解率均超過(guò)60%。

3）5種具有較高汽油降解能力的菌降解汽油的最佳培養(yǎng)條件分別為：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、戈登氏菌屬、銅綠假單胞菌以及博得特氏菌屬的最佳培養(yǎng)溫度均為32 ℃;培養(yǎng)基pH值均為7.0;培養(yǎng)時(shí)間均為20 h。銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌以及戈登氏菌的汽油降解率分別為70.12%、76.42%、75.66%、77.50%和73.22%，且這5種菌對(duì)人體沒(méi)有致病性，也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，可為污染土的生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種。

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（編輯 王秀玲）