人肝癌裸鼠皮下移植瘤早期血液供應(yīng)模式的定量研究

曹 蓉 李若坤 強(qiáng)金偉 李 瀛 劉巧遇 王 杰

（1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院放射科 上海 201508；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院放射科 上海 200025）

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)中肝癌的死亡率高居第四位，占全球癌癥死亡總數(shù)的8.2%，是全球男性癌癥患者死亡的第二大原因［1］。在肝癌血管生成過(guò)程中，顯微鏡下可以觀察到的肝癌微血管異常主要為動(dòng)脈生成及肝竇毛細(xì)血管化［2］。當(dāng)前肝癌血管生成過(guò)程中新生血管的形成機(jī)制仍不明確。經(jīng)典的腫瘤血管生成理論認(rèn)為：腫瘤生長(zhǎng)首先經(jīng)歷無(wú)血管期，當(dāng)瘤體增大時(shí)，單純依賴(lài)彌散供氧已無(wú)法滿(mǎn)足其生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞釋放多種血管生成因子和基質(zhì)蛋白，募集并引導(dǎo)新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育為有功能的毛細(xì)血管袢，與宿主血管相互吻合，隨后新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入腫瘤中，為腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)［3］。1999年美國(guó)學(xué)者 Maniotis等［4］在研究高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)：其內(nèi)部具有一些與血管相連的PAS染色陽(yáng)性的管道樣結(jié)構(gòu)，并將此定義為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）。VM中腫瘤細(xì)胞與血流之間僅有一層基底膜相隔，腫瘤細(xì)胞溶解基底膜后便能直接進(jìn)入血液循環(huán)，使得VM易于發(fā)生血道轉(zhuǎn)移。大量研究證實(shí)VM與腫瘤血行轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及患者的生存期、預(yù)后等密切相關(guān)［5-9］?？鼓[瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞藥物索拉菲尼是治療晚期肝癌的一線藥物，然而，單純針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成治療對(duì)含VM的肝癌療效不佳，甚至促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［10-13］，解釋為索拉菲尼雖然抑制了腫瘤血管內(nèi)皮形成，卻因?qū)е履[瘤細(xì)胞缺氧，促進(jìn)了腫瘤VM的形成［11，13］。故含有 VM的肝癌患者并不適用于單純抗內(nèi)皮血管治療，肝癌VM的機(jī)制研究及病理診斷對(duì)于患者的預(yù)后評(píng)估及治療方案的選擇具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)種瘤后不同時(shí)間點(diǎn)荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)的微血管進(jìn)行病理學(xué)觀察及定量研究，探究肝癌早期血管形成過(guò)程中血液供應(yīng)模式的變化，以期為肝癌抗血管生成藥物的研究提供新的思路。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株人肝癌高轉(zhuǎn)移性單克隆細(xì)胞MHCC97-H（復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供），復(fù)蘇后生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2濕度飽和的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。選用0.25%胰蛋白酶，3～4天消化傳代1次。細(xì)胞消化、凍存及復(fù)蘇等具體方法與其他細(xì)胞株相同。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡雄性SPF級(jí)BALB/c-nu小鼠，體重14～16 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2017-0005］，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房中［SCXK（滬）2015-0001］，飼養(yǎng)期間給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈飲用水（均由上海市公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。房間內(nèi)維持恒溫（22±2）℃，晝夜12 h循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），進(jìn)口澳洲胎牛血清（美國(guó)HyClone公司），0.1 mol/L PBS緩沖液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），DMSO（美國(guó)Sigma公司），4%多聚甲醛（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），醇溶性伊紅染液、蘇木精染液（上海江萊生物科技有限公司），鹽酸酒精染液（北京九州天瑞科技有限公司），二甲苯（南京化學(xué)試劑股份有限公司），無(wú)水乙醇（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司），0.01mol/L PBS緩沖液（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），一抗（CD34）、二抗（EnVision試劑）（丹麥Dako公司），過(guò)碘酸-雪夫溶液染色試劑盒（南京森貝生物科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），恒溫水浴鍋、烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司），倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），通用臺(tái)式低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司），全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、半自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司），切片漂烘溫控儀（安徽省電子科學(xué)研究所）。

皮下瘤移植小鼠動(dòng)物房適應(yīng)1周后進(jìn)行異位皮下移植操作。0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97-H細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞比率大于98%，（233×g）洗滌2次。用無(wú)血清的低溫DMEM高糖培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，以每只裸鼠接種0.2 mL的劑量，于同一時(shí)間接種在40只裸鼠左側(cè)腹股溝區(qū)皮下。所有實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行。

病理染色頸髓脫臼法處死成瘤小鼠，眼科剪切開(kāi)皮膚取出新鮮腫瘤標(biāo)本，剝離表面結(jié)締組織，生理鹽水清洗表面血跡，4%多聚甲醛的固定，石蠟 包 埋 ，4 μm 厚度連 續(xù) 切 片 ，行 HE、CD34及CD34/PAS免疫組化染色使用。

觀測(cè)指標(biāo)

微血管評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 按照Weidner等［14］制定的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，任何CD34陽(yáng)性（染成棕色）的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要能和臨近的微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開(kāi)，就作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)。同一個(gè)血管的“頭”和“尾”正巧在同一切面上，作為2個(gè)血管計(jì)數(shù)；血管內(nèi)徑大于容納8個(gè)紅細(xì)胞及有肌層的血管不作為微血管計(jì)數(shù)。

微血管密度計(jì)數(shù) 在低倍鏡下瀏覽CD34染色切片確定微血管豐富的區(qū)域后，在200倍鏡下，選擇染色清晰、背景對(duì)比良好的3個(gè)視野拍攝照片，利用病理圖文分析軟件計(jì)數(shù)由CD34抗體染成棕色的血管數(shù)目，取其平均值來(lái)表示微血管密度（microvessel density，MVD）（單位：條/視野）。

微血管面積計(jì)數(shù) 微血管面積（microvascular area，MVA）選取方法同MVD，選取200倍視野下3個(gè)微血管豐富的視野拍攝照片，利用病理圖文分析軟件自動(dòng)及手動(dòng)勾勒出微血管管腔，取其平均值來(lái)表示MVA（單位：μm2）。

VM判定標(biāo)準(zhǔn)［15］（1）HE染色腫瘤細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu)，管腔中央有紅細(xì)胞存在；（2）CD34/PAS雙染色示管壁僅有腫瘤細(xì)胞組成，無(wú)CD34染色陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞；（3）一層PAS染色陽(yáng)性基底膜樣結(jié)構(gòu)將腫瘤細(xì)胞與管腔隔開(kāi)；（4）對(duì)于少量管壁由腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同參與構(gòu)成的馬賽克血管（mosaic vessel，MV），亦按照VM判定。

VM計(jì)數(shù) 按照VM的判定標(biāo)準(zhǔn)，先在低倍鏡下瀏覽CD34/PAS雙染色切片，選取微血管豐富的區(qū)域，在400倍鏡下，利用病理圖文分析系統(tǒng)結(jié)合人工判定計(jì)數(shù)PAS陽(yáng)性血管數(shù)，取平均值作為VM數(shù)量（單位：條/視野）。VM百分比=VM數(shù)量/（VM數(shù)量+內(nèi)皮依賴(lài)性血管數(shù)量）×100%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，兩組間比較，服從正態(tài)分布及方差齊性者，使用t檢驗(yàn)，否則采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)比較，服從正態(tài)分布及方差齊性者，使用單因素方差分析，否則采用非參數(shù)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞形態(tài)MHCC97-H在DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中貼壁生長(zhǎng)，情況良好。細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰、透明，細(xì)胞數(shù)量較多，連接成片。細(xì)胞形態(tài)以多角形、多邊形為主，少數(shù)呈圓形，細(xì)胞分泌物較多，細(xì)胞間連接緊密。細(xì)胞核大，核仁明顯且數(shù)目較多，約3～5個(gè)。部分細(xì)胞伸出偽足（圖1）。

圖1 不同放大倍數(shù)下MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)Fig 1 Morphology of MHCC797-H cells at different magnifications

鏡下觀察（1）第2周染色切片示腫瘤邊緣存在粗大的CD34染色陽(yáng)性棕色內(nèi)皮血管（圖2A～C），腫瘤內(nèi)部未見(jiàn)明顯壞死。（2）第3、4周HE染色切片腫瘤邊緣發(fā)現(xiàn)VM（圖2D），其為內(nèi)含紅細(xì)胞的管腔樣結(jié)構(gòu)，管壁未見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞，而是由腫瘤細(xì)胞組成。CD34染色陰性（圖2E），CD34/PAS雙染色示VM管腔樣結(jié)構(gòu)管壁為一層PAS染色陽(yáng)性基底膜樣結(jié)構(gòu)（圖2F）。（3）第5周HE染色切片中見(jiàn)部分管壁由內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞共同圍成，即MV（圖2G）。CD34染色示MV管壁部分染色陽(yáng)性（染成棕色），部分染色陰性（圖2H）。CD34/PAS雙染色示MV管壁同時(shí)存在PAS染色陽(yáng)性基底膜樣結(jié)構(gòu)及棕色陽(yáng)性血管內(nèi)皮，管壁及管腔內(nèi)見(jiàn)腫瘤細(xì)胞（圖2I）。

圖2 人肝癌裸鼠皮下移植瘤中不同血液供應(yīng)模式的病理學(xué)表現(xiàn)Fig 2 Histological characteristics of different blood supply patterns in human hepatocellular carcinoma subcutaneous xenografts in nude mice

定量分析

人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)微血管參數(shù) 第2、3、4、5周腫瘤內(nèi)MVA（μm2）分別為28 795.5±3 412.7、13 720.8±2 375.6、29 221.3±3 958.5和 19 735.5±1 855.5，其中第 2、3周及第 3、4周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3周腫瘤MVA小于第2周（P=0.013），第4周腫瘤MVA大于第3周（P=0.025），MVA呈先下降后升高的趨勢(shì)（圖3）。第2、3、4、5周腫瘤內(nèi)MVD（條/視野）分別為26.1±2.3、28.7±4.9、53.7±11.0、45.4±6.3，不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤內(nèi)MVD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)血管生成擬態(tài)參數(shù)第 2、3、4、5周腫瘤內(nèi) VM（條/視野）數(shù)量分別為25.6±19.8、13.6±7.2、18.7±2.5、54.2±43.1，不 同時(shí)間點(diǎn)腫瘤內(nèi)VM數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2、3、4、5周腫瘤內(nèi)腫瘤內(nèi)VM百分比（%）分別為50.1±14.6、64.2±12.9、84.2±15.4、69.5±21.6，不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤內(nèi)VM百分比不同，其中第2、4周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第4周腫瘤VM百分比高于第2周（P=0.015），VM百分比呈升高趨勢(shì)（圖3）。

圖3 時(shí)間對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)微血管參數(shù)的影響Fig 3 Effect of time on the vascular parameters of the human hepatocellular carcinoma subcutaneous xenografts in nude mice

討 論

既往學(xué)者們認(rèn)為血管新生包括血管生成和血管發(fā)生兩種方式［16-17］，血管生成指宿主既存的血管以芽生的方式形成腫瘤內(nèi)的新生血管［18］，而血管發(fā)生是由受到募集的內(nèi)皮祖細(xì)胞等分化、遷移、增殖，在宿主血管上形成新的血管網(wǎng)絡(luò)［19］。大量的研究通過(guò)阻止腫瘤內(nèi)血管新生過(guò)程，以達(dá)到阻斷腫瘤血供的目的。目前VM的形成機(jī)制仍未明確，研究VM形成機(jī)制對(duì)于研制VM特異性靶向藥物具有重要意義。

本研究于種瘤第3周鏡下可見(jiàn)到典型VM結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)見(jiàn)紅細(xì)胞，CD34/PAS免疫組化雙染色證實(shí)管壁為一層PAS染色陽(yáng)性基底膜樣結(jié)構(gòu)，符合病理學(xué)家Maniotis對(duì)于VM的定義［4］。通過(guò)對(duì)腫瘤不同時(shí)期的微血管進(jìn)行定量研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤的MVA值呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，第3周的MVA較第2周降低，而實(shí)際觀察中第3周腫瘤并未因缺乏血液供應(yīng)而出現(xiàn)明顯的壞死，提示了腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中不僅存在內(nèi)皮依賴(lài)性血管這一種血液供應(yīng)方式。VM定量計(jì)數(shù)結(jié)果顯示腫瘤VM百分比呈明顯升高趨勢(shì)，提示隨著腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤血液供應(yīng)模式由內(nèi)皮依賴(lài)性血管的彌散作用逐漸轉(zhuǎn)換為由VM提供。我們?cè)阽R下也觀察到部分腫瘤細(xì)胞直接存在于管腔中。因此與內(nèi)皮依賴(lài)性血管結(jié)構(gòu)比較，VM特殊的結(jié)構(gòu)更加有利于腫瘤早期快速生長(zhǎng)和增殖。

目前研究報(bào)道的腫瘤內(nèi)血液供應(yīng)方式有VM、MV和內(nèi)皮依賴(lài)性血管等 3種［6，17］。VM 由腫瘤細(xì)胞直接在基底膜樣物質(zhì)的表面形成，管腔內(nèi)無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆。MV由腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同襯覆在管道內(nèi)壁。Zhang等［20］使用活性炭作為示蹤劑證明VM、MV與宿主血液循環(huán)相通，VM、MV也是腫瘤內(nèi)的血液供應(yīng)方式。進(jìn)一步的定量研究［21］發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮下接種后第2周時(shí)，腫瘤組織內(nèi)以VM數(shù)目最多，而當(dāng)小鼠皮下接種后第3周時(shí)，腫瘤組織內(nèi)VM數(shù)目明顯下降，內(nèi)皮依賴(lài)性血管數(shù)目明顯增多?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，Zhang等［20］認(rèn)為黑色素瘤中存在VM、MV和內(nèi)皮依賴(lài)性血管等3種不同的血液供應(yīng)模式，三者間具有時(shí)間延續(xù)性關(guān)系：腫瘤組織內(nèi)以VM數(shù)目最多，為黑色素瘤生長(zhǎng)的主要血液供應(yīng)形式；隨著腫瘤的生長(zhǎng)，內(nèi)皮依賴(lài)性血管數(shù)目增多，逐漸代替VM，故腫瘤內(nèi)的血管由VM逐漸過(guò)渡為內(nèi)皮依賴(lài)性血管，MV可能為VM和內(nèi)皮依賴(lài)性血管間的過(guò)渡形式。與上述研究［21］不同的是，本研究顯示，第4周的VM百分比較第2周升高（P=0.015），表明在腫瘤血管生成的最初階段，腫瘤的血液供應(yīng)模式并非以VM為主，隨著腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，VM成為腫瘤的主要血液供應(yīng)模式。Ricci-Vitiani等［22］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中大部分的內(nèi)皮細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞相同的基因組改變（20%～90%，平均60.7%），血管內(nèi)皮細(xì)胞含有腫瘤發(fā)生細(xì)胞的一個(gè)子集，這些細(xì)胞在免疫受損小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高度血管化的間變性腫瘤，并具有VM區(qū)域。在免疫功能低下的小鼠體內(nèi)原位或皮下注射膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，可產(chǎn)生腫瘤異種移植物，其血管主要由人內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，提示VM可能代表腫瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的不完全過(guò)程。

綜上所述，在人肝癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的早期階段，VM與內(nèi)皮依賴(lài)性血管共存，隨著腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，VM逐漸成為腫瘤的主要血液供應(yīng)模式。本研究顯示了肝癌血管生成過(guò)程中血液供應(yīng)模式的復(fù)雜性，提示針對(duì)內(nèi)皮血管或VM的單一靶向治療藥物不能完全抑制肝癌的血供形成。