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    CⅡTA表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)患者預(yù)后的關(guān)系

    2020-04-17 05:08:32翟長文袁存存路麗明
    關(guān)鍵詞:飲酒分子腫瘤

    薛 乙 湯 迪 翟長文 袁存存 衡 宇 周 梁 陶 磊△ 路麗明

    (1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科,2病理科 上海 200031;3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所 上海 200025)

    喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的類型[1]。喉癌中最常見的病理類型是喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC),約占 96%[2]。喉癌的主要病因是吸煙、飲酒、老年和男性[3-4]。目前LSCC的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療等,盡管診療手段不斷提高,但在過去40年LSCC術(shù)后5年的生存率并無明顯改善[5]。因此迫切需要探索新的治療方法或預(yù)測LSCC術(shù)后與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo),為治愈或延緩進(jìn)展提供新的策略。

    MHC-Ⅱ類反式激活蛋白(classⅡtrans-activator,CⅡTA)屬于NOD樣受體家族成員,是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要成分[6]。炎癥是參與腫瘤形成的重要因素之一[7]。CⅡTA是調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ分子調(diào)控的主控開關(guān),也是IFN-γ激活MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵基因[8]。CⅡTA所調(diào)控的 MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表達(dá)水平與頭頸部腫瘤免疫逃逸機(jī)制有密切的關(guān)系,表明CⅡTA在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的重要性[9]。MHC-Ⅱ分子高表達(dá)的腫瘤通常預(yù)后較好,如非小細(xì)胞性肺癌[10]、肝鱗狀細(xì)胞癌[11]等,而CⅡTA表達(dá)與腫瘤預(yù)后關(guān)系的研究較少,然而最近研究發(fā)現(xiàn)CⅡTA高表達(dá)的腫瘤與較好的預(yù)后相關(guān)[11-12],這引起了我們對CⅡTA表達(dá)水平與LCCC預(yù)后關(guān)系進(jìn)行探索性研究。

    關(guān)于CⅡTA表達(dá)與LSCC患者預(yù)后關(guān)系的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究結(jié)合CⅡTA在LSCC組織的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析,并對CⅡTA表達(dá)水平與LSCC患者的預(yù)后進(jìn)行初步研究,以期對LSCC的診療或預(yù)后評估提供新的思路。

    資料和方法

    臨床資料本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(編號KJ200801),所有患者均簽署知情同意書。收集我院2013年9月至2015年6月收治的80例喉癌患者術(shù)后的腫瘤組織樣本并制作成組織芯片。入組標(biāo)準(zhǔn):(1)首次行腫瘤根治性手術(shù),且術(shù)前未接受過放療、化療;(2)確診為喉鱗狀細(xì)胞癌(術(shù)后病理);(3)隨訪和臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)喉非鱗狀細(xì)胞癌(神經(jīng)內(nèi)分泌癌,腺癌,梭形細(xì)胞癌等);(2)伴有其他腫瘤病史;(3)伴有全身系統(tǒng)性疾病病史(系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn),排除非鱗狀細(xì)胞癌4例,伴有其他腫瘤1例,失訪5例,術(shù)前放療患者3例,最終納入67例。喉癌的TNM臨床分期參考第8版美國癌癥協(xié)會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)制定的標(biāo)準(zhǔn)。吸煙和飲酒人群的界定為:吸煙≥20支/天(持續(xù)時(shí)間≥1年);飲酒≥200 mL/d(持續(xù)時(shí)間≥1年)。目前已經(jīng)戒煙/戒酒的人群(曾經(jīng)吸煙/飲酒),統(tǒng)計(jì)為有吸煙史/飲酒史。隨訪終止時(shí)間為2018年10月16日,隨訪終止或患者死亡為觀察終止時(shí)間,總生存期(overall survival,OS)為LSCC術(shù)后到觀察終止時(shí)間。

    免疫組化免疫組化主要試劑:一抗,兔抗人多克隆CⅡTA抗體(美國Novus公司,NBP2-59072);二抗,HRP山羊抗兔(中國Beyotime公司,A0208);山羊血清(英國Abcam公司,ab7481)。參考CⅡTA免疫組織化步驟,完成實(shí)驗(yàn)。首先,二甲苯浸泡脫蠟,梯度酒精(100%、95%、70%、50%)脫水各5 min;封閉內(nèi)源性過氧化物酶(3%H2O2,15 min),PBS漂洗 3遍(5 min/遍);抗原修復(fù),抗原修復(fù)液(ddH2O:檸檬酸鈉緩沖液=100∶1),微波爐(高火10 min,解凍2 min,中火7 min),待恢復(fù)至室溫取出;加入一抗(1∶300山羊血清稀釋;對照組加入PBS);4℃過夜;16 h后取出:依次用PBST、PBS漂洗(均為3遍,5 min/遍);加入二抗(1∶50山羊血清稀釋);PBS漂洗3次(每次5 min),DAB顯色5 min左右,顯微鏡檢查染色情況,蘇木素復(fù)染,進(jìn)行后續(xù)處理,封片。

    免疫組化結(jié)果分析光學(xué)顯微鏡下觀察位點(diǎn)染色情況,選取3個(gè)不同的視野,按照染色程度與面積計(jì)算染色的強(qiáng)弱,每次評分均由2位病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立完成,且由第3位病理科醫(yī)師復(fù)評以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。染色強(qiáng)度評分:0(-),1(+),2(++),3(+++)。染色面積評分:0(0),1(1%~25%),2(26%~50%),3(51%~75%),4(76%~100%)。根據(jù)染色面積乘以染色強(qiáng)度的結(jié)果分為:CⅡTA低表達(dá)組(0~6分);CⅡTA高表達(dá)組(7~12分)。LSCC的腫瘤/間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),均可認(rèn)為CⅡTA表達(dá)陽性。

    GEPIAGEPIA是一種新開發(fā)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器,基于癌癥基因數(shù)據(jù)庫(TCGA)和基因組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GTEx),且有腫瘤(9 736個(gè))和正常樣本(8 587個(gè))的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)可提供多種功能[13],如腫瘤患者生存分析、類似基因的檢測以及某種基因在腫瘤或正常組織表達(dá)的差異性分析等。利用GEPIA分析CⅡTA的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squanmous cell carcinoma,HNSCC)患者預(yù)后的關(guān)系。

    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)分析CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征的關(guān)系。用Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS,Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算P值。對CⅡTA表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    LSCC癌組織中CⅡTA表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系本次研究共納入67例患者(男性66例,女性1例),年齡38~84歲,平均61歲。根據(jù)免疫組化結(jié)果,分為CⅡTA高表達(dá)組(圖1A)和低表達(dá)組(圖1B)。對CⅡTA的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙、飲酒、臨床分期、喉癌分型、腫瘤大小等臨床特征的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

    圖1 LSCC腫瘤組織中CⅡTA的免疫組化結(jié)果Fig 1 IHC results of CⅡTA in LSCC tumor tissues

    COX回歸多因素分析結(jié)果本研究將CⅡTA的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、飲酒等臨床指標(biāo)納入COX多因素回歸模型,結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA的表達(dá)水平、腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LSCC患者術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)(表2)。飲酒、CⅡTA的表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為LSCC術(shù)后OS的獨(dú)立影響因素。

    LSCC癌組織中CⅡTA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系67例LSCC患者,死亡33例,生存34例。CⅡTA高表達(dá)組41例,平均生存時(shí)間(49.3±2.6)個(gè)月,5年生存率為41.5%(24/41);CⅡTA低表達(dá)組26例,平均生存時(shí)間(35.3±3.9)個(gè)月,5年生存率為38.5%(10/26)。Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS結(jié)果顯示,CⅡTA高表達(dá)比CⅡTA低表達(dá)的患者預(yù)后好(圖2A,P<0.05)。

    TCGA數(shù)據(jù)庫CⅡTA表達(dá)與HNSCC預(yù)后的關(guān)系運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫對CⅡTA的表達(dá)與HNSCC的預(yù)后進(jìn)行分析,可結(jié)合CⅡTA表達(dá)與LSCC預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行與之對比分析。結(jié)果顯示,HNSCC患者中CⅡTA高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后好(圖2B,P<0.05)。

    表2 多變量Cox比例回歸生存分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression survival analysis

    圖2CⅡTA與LSCC/HNSCC預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between CⅡTA and prognosis of LSCC/HNSCC

    討 論

    隨著MHC-Ⅰ/Ⅱ分子在腫瘤免疫逃逸的作用及機(jī)制的研究不斷明確,人們逐步認(rèn)識到CⅡTA在腫瘤免疫的重要性。CⅡTA基因的缺陷會導(dǎo)致裸淋巴細(xì)胞綜合征[14],而CⅡTA分子的表達(dá)異常與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[15]、原發(fā)性縱隔大 B 細(xì)胞淋巴瘤[16]等疾病發(fā)生相關(guān)。Yazawa等[17]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MHC-Ⅱ分子可以將抗原肽呈遞給輔助性T淋巴細(xì)胞,有助于抗腫瘤免疫反應(yīng)。最近有研究認(rèn)為CⅡTA在不同腫瘤組織中的表達(dá),其預(yù)后也不盡相同[12,18],這為探索CⅡTA表達(dá)與腫瘤的關(guān)系提供了一定的研究基礎(chǔ)。我們對CⅡTA分子表達(dá)水平與LSCC患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。

    CⅡTA可在多種腫瘤組織中表達(dá),如三陰性乳腺癌[12]、原發(fā)性縱隔大 B細(xì)胞淋巴瘤[16]、脂肪肉瘤[19]等。根據(jù)IHC結(jié)果,我們分析認(rèn)為CⅡTA在LSCC的腫瘤細(xì)胞以及部分腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。并將CⅡTA表達(dá)情況分為高表達(dá)組(圖1A)和低表達(dá)組,對CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC的臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果可能與研究樣本量的多少有關(guān),值得進(jìn)一步研究。盡管CⅡTA表達(dá)與LSCC臨床特征的分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素回歸分析結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是LSCC術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素(P<0.05),這表明LSCC的發(fā)生可能是一個(gè)復(fù)雜的多因素結(jié)果。

    Kaplan-Meier法對LSCC術(shù)后5年的生存分析顯示,CⅡTA高表達(dá)比低表達(dá)的LSCC患者術(shù)后預(yù)后好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Xie等[11]研究認(rèn)為,肝鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中CⅡTA高表達(dá)經(jīng)常伴有MHC-Ⅱ分子的表達(dá),且術(shù)后的無進(jìn)展生存期更長。Forero等[12]在對三陰性乳腺癌患者術(shù)后長達(dá)11年的隨訪后認(rèn)為,CⅡTA高表達(dá)的三陰性乳腺癌有較好的預(yù)后,CⅡTA表達(dá)是三陰性乳腺癌術(shù)后無進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。我們推測CⅡTA高表達(dá)的LSCC患者預(yù)后較好可能與MHC-Ⅱ分子的表達(dá)增加相關(guān),其在LSCC腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng),加強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。我們運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CⅡTA的mRNA水平對HNSCC患者的預(yù)后價(jià)值,對研究結(jié)果進(jìn)行輔助性驗(yàn)證,結(jié)果顯示CⅡTA高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    然而,有研究認(rèn)為CⅡTA的表達(dá)可能是增加腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。Tan等[18]認(rèn)為CⅡTA表達(dá)升高能夠增加腎透明細(xì)胞癌的死亡風(fēng)險(xiǎn),CⅡTA的過表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ分子參與免疫反應(yīng),加劇機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致癌癥進(jìn)展加快。CⅡTA表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后的關(guān)系不同,這可能與CⅡTA分子所處的腫瘤微環(huán)境不同密切相關(guān),以至于CⅡTA在不同腫瘤類型發(fā)揮的作用可能不同,仍待進(jìn)一步的研究和探討。本研究仍有許多局限性:納入的臨床病例樣本量不夠大;納入的女性LSCC病例數(shù)相對較少;隨訪時(shí)間不夠長。

    總之,CⅡTA作為調(diào)控MHC-Ⅱ分子表達(dá)的關(guān)鍵基因,在參與腫瘤免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示CⅡTA高表達(dá)的LSCC患者比低表達(dá)者預(yù)后好(OS)。本研究結(jié)果提示CⅡTA表達(dá)水平可能對LSCC患者術(shù)后診療及預(yù)后的預(yù)測有一定的參考意義。

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