外泌體相關(guān)跨膜蛋白上調(diào)整合素促進肝細胞癌中細胞遷移的研究

闞寵　黎建昌　黃小程　陳福禹　方東　傅后杰　盧東軍　陳耀林　倪安妮　李根亮

【摘要】目的 探討外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因在肝細胞癌（HCC）中的作用及可能的作用機制。方法 以癌癥來源外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因為背景，以模型小鼠HCC組織和健康肝組織為材料，以RNA-seq和生物信息學作為分析手段進行研究。結(jié)果 于HCC中發(fā)現(xiàn)138個差異表達的外泌體跨膜蛋白基因，它們共參與11個生物學程序、28個細胞組分、9個分子功能、1個信號通路和5個編碼蛋白序列特征。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼的蛋白多數(shù)含有拓撲結(jié)構(gòu)域，主要參與細胞遷移、整合素信號通路、細胞粘連及癌癥蛋白聚糖信號通路，而且一些外泌體來源跨膜蛋白還具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能。結(jié)論 HCC中外泌體相關(guān)跨膜蛋白主要在細胞膜表面通過上調(diào)整合素和癌癥蛋白聚糖途徑，以蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能影響細胞粘連，促進HCC中的細胞遷移。

【關(guān)鍵詞】肝細胞癌;外泌體;跨膜蛋白;整合素;細胞遷移

中圖分類號：R735.7 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.03.006

Downregulation of exosome-associated transmembrane proteins inhibits liver cancer cell migration

KAN Chong1，LI Jianchang1，HUANG Xiaocheng1，CHEN Fuyu1，F(xiàn)ANG Dong1，F(xiàn)U Houjie1，LU Dongjun1，CHEN Yaolin2，NI Anni3，LI Genliang4

（Youjiang Medical University for Nationalities 1.2016 Undergraduate in Clinical Medicine，2.2015 Undergraduate in Clinical Medicine，3.Graduate School，4.Department of Biochemistry and Cell Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Baise 533000，Guangxi China）

【Abstract】Objective The purpose of this study was to investigate the role of exosome related transmembrane protein genes in hepatocellular carcinoma （HCC） and the possible mechanism.Methods The background of cancer derived exosomes related transmembrane protein genes was studied.HCC tissues from mouse model and healthy liver were used as materials.And RNA-seq and bioinformatics were used as analytical methods.Results There were 138 differentially expressed transmembrane protein genes in HCC.These genes participated in 11 biological processes;formed 28 cell components，9 molecular functions，1 KEGG pathway and 5 UP_seq feature.Further analysis showed that most of the proteins encoded by these genes contain topological domains，which were mainly involved in cell migration，integrin signaling pathways，cell adhesions and proteoglycan signaling pathways in cancer，and some exosomal transmembrane proteins had protein binding，calcium ion binding，and transferase activity.Conclusion Exosome related transmembrane proteins in HCC? mainly regulate the syntaxin and cancer proteoglycan pathways on the surface of cell membrane.The molecular functions of protein binding，calcium binding and transferase activity affect cell adhesion and promote cell migration in HCC.

【Key words】hepatocellular carcinoma;exosomes;transmembrane proteins;integrin;cell migration

1983年，約翰斯通初次在綿羊的網(wǎng)織紅細胞上發(fā)現(xiàn)了外泌體。它可由不同細胞產(chǎn)生并釋放[1]。并且經(jīng)由細胞分泌的外泌體含有不同的生物學功能，如增殖分化、細胞遷移、介導細胞間物質(zhì)傳遞及交流等。腫瘤細胞分泌的外泌體可促進癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]，但也有的能夠抑制腫瘤的生長發(fā)育[3]。外泌體內(nèi)也存在一些相關(guān)跨膜蛋白，它們也能夠影響腫瘤細胞的黏附、分化、遷移及侵襲[4～5]。但腫瘤來源的外泌體相關(guān)跨膜蛋白參與完成這些功能的機制還有待進一步研究。本研究以實驗室前期構(gòu)建的肝細胞癌（HCC）模型小鼠的瘤體組織和健康對照小鼠的肝組織進行RNA-seq，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載腫瘤來源外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，構(gòu)建比對數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用生物信息學手段，篩選瘤體組織中差異表達的外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，再通過功能富集獲得外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因（exosome-associated transmembrane proteins-encoding genes，ETPGs）在癌組織中的作用，探討ETPGs在HCC中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 肝癌小鼠模型的構(gòu)建和RNA-seq

7周齡健康昆明小鼠100只購自右江民族醫(yī)學院動物實驗中心。參照前期實驗的方法[6]，50只通過雙前肢腋下注射H22肝癌細胞株構(gòu)建肝細胞癌小鼠模型，另50只同法注射不含H22的生理鹽水作對照。正常飼養(yǎng)4周后，取瘤體組織和對照組小鼠肝組織，以RNA提取試劑盒（Invitrogen，中國上海）提取總RNA（n=50），同組內(nèi)總RNA樣本等量混合用于RNA-seq[6]。生物信息學分析HCC中的差異表達基因，基因表達以每百萬測序堿基中每千個轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(shù)（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，F(xiàn)PKM）表示。

1.2 ETPGs的篩選

從NCBI的nucleotide數(shù)據(jù)庫下載癌癥來源的外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，構(gòu)建基因比對數(shù)據(jù)庫。以差異表達基因與構(gòu)建的基因比對數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得HCC中差異表達的ETPGs（differentially expressed ETPGs，DEEs）。其中以FPKM比值≥2或≤0.5，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.05的基因為DEEs。

1.3 DEEs的功能分析

通過DAVID在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov），對以上獲得的DEEs進行功能富集，對富集到的各功能進行功能注釋聚類，其中以FDR≤0.05的為有統(tǒng)計學意義。

1.4 DEEs編碼蛋白的互作分析

通過STRING 11.0版本軟件（https：//string-db.org/）在線對DEEs編碼蛋白進行互作分析，以此評價HCC中DEEs編碼蛋白在分布和功能上的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 篩選出的DEEs

通過比對分析，我們共篩選出138個DEEs。見表1。

2.2 篩選出的DEEs的功能

對篩選出的DEEs經(jīng)功能富集分析，結(jié)果顯示共富集到11個生物學程序（biological process，BP）、28個細胞組分（cellular component，CC）、9個分子功能（molecular function，MF）、1個信號通路（KEGG pathway，KP）和5個編碼蛋白序列特征（UP_seq feature，US），見圖2、圖3。從28個CC可以看出，大量跨膜蛋白相關(guān)基因編碼蛋白分布于胞膜區(qū)域和細胞連接部分。而從11個BP可以看出，這些基因編碼跨膜蛋白參與的生物學過程，是細胞粘連（14個基因）、整合素信號通路（6個基因）、細胞遷移調(diào)控（7個基因）等。9個MF顯示這些基因編碼蛋白主要具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等功能。1條信號通路則是癌癥中的蛋白聚糖信號途徑（8個基因）。HCC中相關(guān)基因編碼蛋白的互作見圖4。

3 討論

研究證實，跨膜蛋白在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[7]。我們通過對HCC中DEEs的分析，發(fā)現(xiàn)在HCC中存在138個相關(guān)差異表達基因。功能富集結(jié)果顯示，這些DEEs共參與11個BP、28個CC、9個MF、1個KP和5個US。它們的生理功能主要集中在細胞遷移的調(diào)控、整合素信號通路和細胞粘連，在細胞連接和細胞膜處發(fā)揮作用。

整合素家族作為細胞黏附分子中的一類，是連接細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相互作用的一種細胞表面糖蛋白受體，在肝癌黏附轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。整合素可以介導低剪切力以誘導肝癌細胞的遷移[9]，而IL-8可上調(diào)整合素α亞基的表達，但各亞基具有濃度性差異，其調(diào)控作用可能具有差異性，但確實可以促進癌細胞遷移[10]。反義整合素αV、β3基因治療對腫瘤的生長有明顯的抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用整合素αVβ3反義基因治療對腫瘤生長的抑制作用更為顯著[11]，在Hep3B細胞中消減整合素α7（ITGA7）的表達，能明顯抑制細胞克隆形成和細胞遷移[12]。整合素表達的減少有可能抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。我們的研究結(jié)果表明，整合素在參與肝癌的發(fā)生發(fā)展等過程中，可能能夠通過上調(diào)表達來促進腫瘤遷移。在我們的研究中，外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因中也出現(xiàn)了四跨膜蛋白家族等跨膜蛋白基因。整合素和生長因子、蛋白酶等可組成跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞黏附、遷移、增殖、分化等生理過程[14～15]。我們發(fā)現(xiàn)，在HCC中，與整合素相關(guān)的多種基因表達上調(diào)，表明HCC癌組織細胞膜中整合素可能被激活表達，以達到促進肝癌細胞遷移的目的。這些跨膜蛋白具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能，表明其發(fā)揮作用主要是通過這些方式實現(xiàn)的。KEGG分析表明，整合素和跨膜蛋白相關(guān)基因也參與以上GO功能相關(guān)的1個信號通路，即癌癥蛋白聚糖信號途徑。這些結(jié)果表明，在HCC中，多種相關(guān)基因出現(xiàn)異常表達，并參與蛋白聚糖信號途徑。說明整合素等跨膜蛋白的表達上調(diào)通過蛋白聚糖信號途徑發(fā)揮著極其重要的作用。本研究中差異表達基因的編碼蛋白的互作分析同樣說明了這些基因功能的相關(guān)性。

綜上所述，在HCC中共有138個DEEs，其功能主要集中在細胞粘連、整合素信號通路、細胞遷移調(diào)控、癌癥蛋白聚糖信號通路等方面。HCC中外泌體相關(guān)跨膜蛋白可能利用上調(diào)整合素，以蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性的方式，通過細胞黏附，以癌癥中的蛋白聚糖信號途徑促進HCC中細胞的遷移。

參 考 文 獻

[1]IBRAHIM A，MARBN E.Exosomes：Fundamental biology and roles in cardiovascular physiology[J].Annu Rev Physiol，2016，78（1）：67-83.

[2]王璐，孟琳，劉樹威，等.外泌體的產(chǎn)生及其生物學作用的研究進展[J].吉林大學學報（醫(yī)學版），2018，44（5）：1109-1114.

[3]HUANG P Y，ZENG T T，LI M Q，et al.Proteomic analysis of a nasopharyngeal carcinoma cell line and a nasopharyngeal epithelial cell line[J].Tumori，2015，101（6）：676-683.

[4]ZHANG X A，BONTRAGER A L，Hemler M E.Transmembrane-4 superfamily proteins associate with activated protein kinase C（PKC） and link PKC to specific beta （1） integrins[J].J Biol Chem，2001，276（27）：25005-25013.

[5]何磊，柯愛武，郭傳勇.四跨膜蛋白在肝癌中的作用[J].中國腫瘤臨床，2011，38（18）：1175-1178.

[6]LI G L，NI A N，YU M Y.Pretumor microenvironment of hepatocellular carcinoma：Cancerization or anticancerization？[J].Gene，2019，701：46-54.

[7]計斌，劉暉.四跨膜蛋白CD151與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[J].現(xiàn)代診斷與治療，2010，21（3）：164-167.

[8]鄭繼軍，王閣.肝癌粘附轉(zhuǎn)移中相關(guān)整合素的作用研究現(xiàn)狀[J].第三軍醫(yī)大學學報，2006，28（2）：176-178.

[9]王利娟，劉肖珩，余泓池，等.整合素介導低剪切力誘導的肝癌細胞遷移[J].生物醫(yī)學工程學雜志，2014，31（2）：336-340.

[10]王毅，楊振華，李雪丹，等.IL-8通過整合素調(diào)控肝癌HepG2細胞遷移[J].軍事醫(yī)學，2016，40（8）：623-627.

[11]李杰，陳孝平，徐宗珍，等.反義整合素αV、β3基因抑制裸鼠種植性肝癌生長的研究[J].中華普通外科雜志，2008，23（4）：285-288.

[12]許斌，褚偉強，萬波，等.整合素 α7在肝癌組織中上調(diào)表達及對肝癌細胞增殖和遷移的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2017，16（20）：2014-2017.

[13]劉濤，蔡紹先，陳瑋瑩.整合素與肝癌[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，16（8）：1432-1434.

[14]張黎穎，成軍，紀冬，等.四跨膜蛋白超家族與肝炎病毒的關(guān)系[J].胃腸病學和肝病學雜志，2004，13（1）：90-93.

[15]李春艷，高勝蘭，劉剛.四跨膜蛋白超家族Tetraspanins在腫瘤及纖維化疾病中的作用概況[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2018，18（3）：372-377.

（收稿日期：2019-11-27 修回日期：2020-02-06）

（編輯：梁明佩）

基金項目：廣西自然科學基金（2016GXNSFAA380177，2015 GXNSFAA139219）;廣西壯族自治區(qū)級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201810599046，201810599039）;右江民族醫(yī)學院校級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201810599113）

作者簡介：闞寵，男，醫(yī)學本科在讀。E-mail：3491797385@qq.com

通信作者：李根亮。E-mail：ligenliang@163.com

[本文引用格式]闞寵，黎建昌，黃小程，等.外泌體相關(guān)跨膜蛋白上調(diào)整合素促進HCC中細胞遷移的研究[J].右江醫(yī)學，2020，48（3）：188-193.