TLR4和腸道菌群在原發(fā)性肝癌進(jìn)展中動(dòng)態(tài)變化及與預(yù)后的關(guān)系

王雨 許達(dá)峰 周開(kāi)倫 武金才 丁驛超 古海強(qiáng) 謝明微 林明花

原發(fā)性肝癌是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，致病因素多種多樣，在我國(guó)，以HBV感染為主，可進(jìn)展為肝硬化和或甚至肝癌，威脅生命安全[1-2]。Toll-樣受體4(toll like receptors 4，TLR4)隸屬于TLR家族，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體，在固有免疫反應(yīng)及獲得性免疫反應(yīng)中均占有重要地位[3-4]。研究表明，TLR4可通過(guò)激活Toll受體結(jié)構(gòu)域、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)等，誘導(dǎo)下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 活化，啟動(dòng)IFC軸[5]。腸道菌群是指寄居在人體腸道內(nèi)所有微生物，研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主代謝和免疫功能等參與疾病的發(fā)生發(fā)展，疾病進(jìn)展過(guò)程中菌群差異明顯[6]。本研究探討TLR4和腸道菌群在原發(fā)性肝癌進(jìn)展中動(dòng)態(tài)變化，并分析其與臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月至2017年6月于本院診治的100例慢性乙型肝炎、80例肝硬化合并乙型肝炎和60例肝癌合并乙型肝炎作為研究對(duì)象，診斷均符合《內(nèi)科學(xué)·第8版》對(duì)應(yīng)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝癌患者臨床分期Ⅰ-Ⅲ期；②所有肝癌患者均給予根治性手術(shù)治療；③所有患者資料均完整；排除：①合并其他類型肝炎患者；②合并其它惡性腫瘤者；③合并其他胃腸道疾病者；④近1月內(nèi)未給予任何治療者。乙型肝炎組：男65例，女35例；平均年齡(45.8±7.2)歲；肝硬化組：男53例，女27例；平均年齡(45.2±6.8)歲；肝癌組：男41例，女19例；平均年齡(46.1±7.7)歲；3組在性別、年齡等一般資料上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另選取同期年齡及性別與前3組匹配的100名健康體檢者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均知情并簽署同意書，并已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、各組外周血單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)檢測(cè)

入組后第1天，抽取各組研究對(duì)照空腹靜脈血3 mL于EDTA抗凝管，充分混勻；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)：每份血液標(biāo)本有2支試管(各含100 μL抗凝血血液標(biāo)本)，1支分別加入FITC-CD14單抗(5 μL)和PE-TLR4單抗(5 μL)，另一支試管加入PBS液(5 μL)，充分搖勻，4℃靜置30 min，后向2支試管中加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，室溫避光靜置20 min，PBS洗滌2次，離心棄上清，加PBS調(diào)整濃度，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率。

三、腸道菌群分布檢測(cè)

收集各組新鮮大便，取0.5 g標(biāo)本按10倍系列稀釋法將其稀釋，后分別用MRS瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及大腸埃希菌，培養(yǎng)2～3 d后用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的半自動(dòng)微生物鑒定儀及軟件進(jìn)行鑒定，并計(jì)算每克糞便濕重中菌落形成單位對(duì)數(shù)值(lg CFU/g)。

四、隨訪

對(duì)60例肝癌患者進(jìn)行隨訪，記錄1年內(nèi)其復(fù)發(fā)和生存情況。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組外周血單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平比較

對(duì)照組、乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率分別為(34.92±4.79)%、(41.92±7.46)%、(49.21±8.83)%和(57.62±10.58)%，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.624，P<0.01)其中乙型肝炎組高于對(duì)照組(t=7.896，P<0.01)，肝硬化組高于乙型肝炎組(t=6.002，P<0.01)，肝癌組高于肝硬化組(5.120，P<0.01)。

二、各組腸道菌群分布比較

4組乳酸桿菌和雙歧桿菌含量依次減少，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組腸球菌和大腸埃希菌含量依次增多，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腸道菌群分布比較(lg CFU/g,±s)

注：與對(duì)照組比較，①t=7.260；②t=5.814；③t=10.149；④t=9.044；與乙型肝炎組比較，At=6.197；Bt=4.197；Ct=6.600；Dt=8.588；與肝硬化組比較，at=5.706，；bt=8.193；ct=5.125；dt=4.309;均P<0.01

三、單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)與腸道菌群分布的關(guān)系

經(jīng)Pearson相關(guān)分析得知，單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)與乳酸桿菌和雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)(r=-0.643，P=0.012；r= -0.672，P=0.021)；與腸球菌和大腸埃希菌呈正相關(guān)(r=0.771，P=0.008；r= 0.734，P=0.010)。

四、單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪1年，60例肝癌患者中，18例復(fù)發(fā)，15例死亡。復(fù)發(fā)者外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率為(59.32±9.17)%，明顯高于未復(fù)發(fā)者的(55.21±5.23)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.200，P=0.032)；死亡者外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率為61.04±10.23)%，明顯高于生存者的(53.29±8.11)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.998，P=0.004)。

五、腸道菌群分布與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

與未復(fù)發(fā)者比較，復(fù)發(fā)者雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯減少，但腸球菌和大腸埃希菌含量則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與生存者比較，死亡者復(fù)發(fā)者雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯減少，但腸球菌和大腸埃希菌含量則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 腸道菌群分布與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系(lg CFU/g,±s)

注：與復(fù)發(fā)者比較，①t=3.305；②t=3.691；③t=3.441；④t=3.596；與死亡者比較，At=4.596；Bt=4.288；Ct=4.382；Dt=4.437;均P<0.01

討 論

在TLR家族中，共有10個(gè)基因(TLR1-TLR10)可介導(dǎo)機(jī)體免疫功能[7]。TLR4是一種跨膜蛋白，主要包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)和胞外結(jié)構(gòu)[8]。其中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)主要包含Toll 受體結(jié)構(gòu)域；而胞外結(jié)構(gòu)則包含多個(gè)亮氨酸重復(fù)序列，可特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎中TLR4識(shí)別PAMP后可激活MyD88-NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)肝臟相關(guān)炎癥因子、趨化因子及相關(guān)介質(zhì)，最終使肝臟發(fā)生病理改變[10]。在本研究中，對(duì)照組、乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率呈逐步升高，提示TLR4可促進(jìn)HBV-肝硬化-肝癌進(jìn)程，這與周東曉等[11]學(xué)者部分結(jié)論基本一致，但其與肝癌預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。隨訪1年發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)者外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于未復(fù)發(fā)者，死亡者外周血CD14+TLR4+單核細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于生存者，提示TLR4與肝癌預(yù)后密切相關(guān)，有望成為肝癌預(yù)后監(jiān)測(cè)及評(píng)估的重要指標(biāo)。

肝臟是人體最大的代謝器官，此外，其還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[12]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中人體腸道形成了穩(wěn)定的腸道菌群，約有10萬(wàn)億個(gè)，其中可被培養(yǎng)的有400多種，主要分為以雙歧桿菌為代表的優(yōu)勢(shì)菌群和以大腸埃希菌為代表的次要菌群，其代謝產(chǎn)物主要由肝臟門脈系統(tǒng)完成分解及排放，與肝臟關(guān)系密切，共同承擔(dān)著調(diào)節(jié)代謝和免疫的作用[13]。當(dāng)人體患肝病時(shí)，代謝解毒能力明顯降低，而腸道菌群多樣性降低，有害菌群數(shù)量及代謝產(chǎn)物明顯升高，構(gòu)成惡性循環(huán)，加重肝臟損傷[14]。近年，腸道菌群與肝臟代謝的關(guān)系逐漸成為治療和預(yù)防肝病的熱點(diǎn)之一。而糞便是腸道菌群和宿主代謝產(chǎn)物的共同排泄方式，在一定程度上可以反映腸道菌群狀態(tài)[15]。本研究腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌群代表雙歧桿菌和乳酸桿菌在慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者中依次減少，而其有害菌群代表大腸埃希菌和腸球菌則依次升高，提示腸道菌群變化與HBV-肝硬化-肝癌進(jìn)展密切相關(guān)。此外，與未復(fù)發(fā)者和生存者比較，復(fù)發(fā)者和死亡者雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯減少，但腸球菌和大腸埃希菌含量則明顯升高，提示腸道菌群變化在肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)中也具有一定價(jià)值。綜合以上結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)TLR4和腸道菌群變化在HBV-肝硬化-肝癌進(jìn)展及肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)中都有一定價(jià)值，為此，本研究進(jìn)行了Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)與乳酸桿菌和雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)，與腸球菌和大腸埃希菌呈正相關(guān)，說(shuō)明TLR4表達(dá)水平越高，乳酸桿菌和雙歧桿菌水平越少，而腸球菌和大腸埃希菌則越多，提示TLR可能與腸道菌群相輔相成共同影響著肝臟結(jié)構(gòu)。

綜上認(rèn)為，TLR4可促進(jìn)乙型肝炎進(jìn)展為肝癌，與腸道菌群變化明顯相關(guān)，兩者在肝癌預(yù)后監(jiān)測(cè)中有一定價(jià)值。但關(guān)于TLR4與腸道菌群中的相互作用機(jī)制及對(duì)肝癌進(jìn)展的影響尚不清楚，有待后續(xù)繼續(xù)探討，且未涉及其在肝癌預(yù)后監(jiān)測(cè)的具體價(jià)值分析。