千金藤素通過MAT2B調節(jié)MAPK信號通路對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

尹楊峰，蔣磊

·論著·

千金藤素通過MAT2B調節(jié)MAPK信號通路對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

尹楊峰，蔣磊

230001 合肥，安徽省第二人民醫(yī)院藥學部

研究千金藤素對人宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其分子機制。

不同濃度的千金藤素作用于宮頸癌細胞 SiHa 后，四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞活力變化，流式細胞術檢測細胞凋亡，實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）和 Western blot 檢測 MAT2B表達水平的變化，確定最佳藥物濃度。將蛋氨酸腺苷轉移酶 2B（MAT2B）小干擾 RNA（si-MAT2B）轉染 SiHa 細胞，檢測細胞活力和凋亡情況。將 MAT2B 過表達載體（pcDNA-MAT2B）轉染 SiHa 細胞，經(jīng)千金藤素處理后，檢測細胞活力、凋亡情況以及磷酸化的 p38 分裂原激活蛋白激酶（p-p38 MAPK）和磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶 1/2（p-ERK1/2）表達變化。

在不同給藥時間下，隨著千金藤素濃度的增加，SiHa 細胞活力逐漸降低，細胞凋亡率逐漸升高，MAT2B 的表達水平逐漸降低，確定 20 mg/L 為最佳有效濃度。si-MAT2B 轉染后 SiHa 細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（< 0.05）。千金藤素處理后 SiHa 細胞 p-p38 MAPK 和 p-ERK1/2 蛋白的表達顯著降低（< 0.05）。pcDNA-MAT2B 轉染并經(jīng)千金藤素處理后，SiHa 細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，p-p38 MAPK 和 p-ERK1/2 蛋白的表達顯著升高（< 0.05）。

千金藤素通過下調 MAT2B 抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制與抑制MAPK 信號通路有關。

千金藤素； 宮頸癌； 蛋氨酸腺苷轉移酶 2B； MAPK 信號通路； 細胞增殖； 凋亡

宮頸癌是第三常見的婦科惡性腫瘤，占女性癌癥相關死亡的10% ~ 15%[1]。目前手術治療主要用于宮頸癌早期患者，對于晚期或復發(fā)轉移患者多采用化療。化療的毒副反應、耐藥性是導致化療失敗的主要原因。因此，尋找新的安全、低毒、高效的抗腫瘤藥物是亟待解決的重大問題。千金藤素（cepharanthine，CEP）是從防己科植物千金藤根中提取的天然生物堿，大量研究表明 CEP 具有多種抗腫瘤作用，包括抑制細胞增殖、抑制血管生成[2]、誘導細胞自噬[3]、抑制腫瘤轉移[4]以及化療增敏作用[5]。已有研究顯示，CEP 通過調節(jié)基因表達誘導肺癌[6]、子宮內膜癌[7]等多種癌細胞凋亡，但 CEP 對宮頸癌的抗腫瘤作用并未完全闡明。蛋氨酸腺苷轉移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）2B 基因屬于 MAT 家族成員之一，其最初在肝癌中被證實發(fā)揮癌基因作用，隨后其在結腸癌[8]、三陰性乳腺癌[9]等腫瘤發(fā)生中的作用被逐步揭示，靶向 MAT2B 有望成為腫瘤治療的重要手段。但 MAT2B 在宮頸癌中作用尚不清楚，CEP 能否調節(jié) MAT2B 表達進而調控宮頸癌細胞增殖和凋亡也尚未可知。因此，本研究通過觀察 CEP 對宮頸癌細胞 SiHa 增殖和凋亡的影響，檢測細胞內 MAT2B 表達變化，探討 CEP 調控宮頸癌細胞增殖和凋亡的分子機制，以期為 CEP 在宮頸癌治療中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮頸鱗癌 SiHa 細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素雙抗購于美國 Gibco 公司；千金藤素（純度 > 98%，CAS 號 481-49-2）和紫杉醇（paclitaxel，PTX，純度 > 98%，CAS 號 33069-62-4）購于上海源葉生物有限公司；小干擾 RNA 對照（si-con）、MAT2B 小干擾 RNA（si-MAT2B）、空載體（pcDNA）、MAT2B 過表達載體（pcDNA-MAT2B）以及 PCR 引物均由上海吉瑪公司提供；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白 V 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司；Trizol 試劑、RIPA 細胞裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購于上海碧云天生物科技有限公司；兔源 MAT2B 抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔II 抗購于武漢菲恩生物科技有限公司；兔源 p38 分裂原激活蛋白激酶（p38 MAPK）、細胞外信號調節(jié)激酶 1/2（ERK1/2）、磷酸化的 p38 MAPK（p-p38 MAPK）、磷酸化的 ERK1/2（p-ERK1/2）、肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國 CST 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用 DMEM 培養(yǎng)基（添加 10% 胎牛血清和 1% 的青鏈霉素雙抗）培養(yǎng) SiHa 細胞。培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 細胞分組和處理 將 SiHa 細胞隨機分為 CEP 0 mg/L、CEP 10 mg/L、CEP 20 mg/L、CEP40 mg/L、PTX 5 mg/L 組、si-con 組、si-MAT2B 組、CEP + pcDNA 組和CEP + pcDNA-MAT2B 組。CEP 處理組分別采用不同濃度的 CEP 孵育培養(yǎng) 24、48 和 72 h。PTX 組為陽性對照，采用 PTX 濃度為 5 mg/L 的培養(yǎng)液處理細胞 48 h。si-con 組、si-MAT2B 組為分別轉染 si-con、si-MAT2B 的 SiHa細胞。CEP + pcDNA 組、CEP + pcDNA-MAT2B 組為將 pcDNA、pcDNA-MAT2B 分別轉染 SiHa 細胞后采用 CEP（20 mg/L）處理 48 h。細胞轉染參照脂質體 Lipofectamine2000 說明書。

1.2.3 MTT 法檢測細胞活力 選取生長狀態(tài)良好的 SiHa 細胞，按照 5 × 103個/孔密度接種于 96 孔板，培養(yǎng)箱內過夜后，分別加入不同濃度的 CEP，在作用 24、48 和 72 h 時間點，每孔加入20 μl 5% 的 MTT 溶液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去上清后每孔加入 150 μl 的 DMSO，振蕩混勻后，酶標儀檢測 490 nm 波長處吸光度值?；蛘咴趕i-con、si-MAT2B 轉染至 SiHa 細胞 24、48 和72 h 時間點，按照上述步驟檢測細胞活力。同時，將轉染 pcDNA、pcDNA-MAT2B 48 h 的 SiHa 細胞接種至 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，棄去原有培養(yǎng)基，采用 20 mg/L CEP 的培養(yǎng)液孵育細胞 48 h，按照上述方法檢測細胞存活情況。每組設置 3 個復孔，實驗重復 3 次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集按照 1.2.2 分組進行相應處理的各組細胞，1000 ×離心 5 min，棄去上清液，采用 PBS 洗滌各組細胞3 次。向離心管內加入 100 μl 的結合緩沖液重懸細胞，分別加入 5 μl 的 Annexin V-FITC 和 5 μl 的PI 染液，混勻后，室溫避光孵育15 min，補充400 μl 的結合緩沖液后立即進行流式細胞儀檢測。每組設置 3 個平行實驗，重復 3 次。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 MAT2B mRNA 的表達水平 收集不同濃度 CEP 處理 48 h 的各組SiHa 細胞，Trizol 法提取各組細胞的總 RNA，紫外分光光度計測定總 RNA 濃度和純度。將 RNA 逆轉為 cDNA 后，采用 qRT-PCR 檢測各組 SiHa 細胞中 MAT2B mRNA 表達情況，以 β-actin 為內參，采用 2-ΔΔCt法計算 MAT2B mRNA 的表達水平。MAT2B 上游引物序列5' ACAGAGAGGAAGACA TACCAG 3'，下游引物序列5' GTTCATTGCCAGA CCAGTG 3'；β-actin 上游引物序列 5' CCAACCGC GAGAAGATGA 3'，下游引物序列 5' CCAGAGGC GTACAGGGATAG 3'。每組設置 3 個平行實驗，重復3 次。

1.2.6 Western blot 檢測 MAT2B、MAPK/ERK 信號通路相關蛋白的表達水平 收集按照1.2.2 分組進行相應處理的各組細胞，RIPA 細胞裂解液裂解細胞，12 000 ×離心 10 min，收集上清 BCA 法定量。取 30 μg 蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，采用電轉裝置將蛋白轉移至 PVDF 膜，然后采用 5% 脫脂牛奶側擺搖床室溫封閉1 h，加入一抗（MAT2B 稀釋比例為 1:800；p-p38 MAPK、p38 MAPK、ERK1/2 和 β-actin 稀釋比例為1:1000；p-ERK1/2 為 1:2000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次后，采用增強化學發(fā)光法進行顯影拍照，隨后進行灰度分析。每組設置 3 個平行實驗，重復 3 次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同濃度的千金藤素對宮頸癌細胞 SiHa 活力的影響

分別采用不同濃度（0、10、20、40 mg/L）的千金藤素處理 SiHa 細胞。作用 48 和 72 h 時，與 0 mg/L 組比較，千金藤素處理組宮頸癌細胞 SiHa 活力顯著降低（< 0.05），并呈一定的劑量依賴性（圖 1）。當千金藤素濃度達到 20 mg/L 時，其對宮頸癌細胞 SiHa 的增殖抑制作用已具有統(tǒng)計學意義，因此選擇 20 mg/L 作為最佳濃度進行后續(xù)研究。

2.2 不同濃度的千金藤素對宮頸癌細胞 SiHa 凋亡的影響

分別采用不同濃度（0、10、20、40 mg/L）的千金藤素處理 SiHa 細胞 48 h，與 0 mg/L 組比較，千金藤素處理組 SiHa 細胞凋亡率顯著增加（< 0.05），并呈一定的劑量依賴性（圖 2）。當千金藤素濃度達到 20 mg/L 時，已有顯著差異，因此選擇 20 mg/L作為最佳濃度進行后續(xù)研究。

2.3 不同濃度的千金藤素對宮頸癌細胞 SiHa 中 MAT2B 表達的影響

分別采用不同濃度（0、10、20、40 mg/L）的千金藤素處理 SiHa 細胞 48 h，與 0 mg/L 組比較，千金藤素處理組 SiHa 細胞 MAT2B mRNA 和 MAT2B 蛋白的表達水平顯著降低（< 0.05），并呈一定的劑量依賴性（圖 3）。當藥物濃度達到20 mg/L 時已有顯著差異，后續(xù)選擇 20 mg/L 千金藤素濃度進行研究。

2.4 沉默 MAT2B 對宮頸癌細胞 SiHa 活力和細胞凋亡的影響

圖 4 顯示，與 si-con 組比較，si-MAT2B 組 SiHa 細胞 MAT2B 蛋白的表達水平顯著降低，在 24、48、72 h 時間點細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（< 0.05）。

2.5 過表達 MAT2B 部分逆轉千金藤素對宮頸癌細胞 SiHa 的促進作用

圖 5顯示，與 NC 組比較，CEP 組 SiHa 細胞 MAT2B 蛋白的表達水平顯著降低，SiHa 細胞在 24、48、72 h 時間點細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與 CEP + pcDNA 組比較，CEP + pcDNA-MAT2B 組 SiHa 細胞 MAT2B 蛋白的表達水平顯著升高，SiHa 細胞在 24、48、72 h 時間點細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（< 0.05）。

Figure 2 Effect of cepharanthine on apoptosis of cervical cancer cells SiHa (A: Flow cytometry detects apoptosis of SiHa; B: Cervical cancer cell SiHa apoptosis rate;*< 0.05)

圖 3 千金藤素對宮頸癌細胞SiHa MAT2B mRNA和蛋白表達的影響（A：對MAT2B mRNA 表達的影響；B：對MAT2B 蛋白表達的影響；*P < 0.05）

Figure 3 Effect of cepharanthine on expression of mRNA and protein of MAT2B in cervical cancer cells SiHa (A: Effect on MAT2B mRNA expression; B: Effect on MAT2B protein expression;*< 0.05)

圖 4 沉默MAT2B 對宮頸癌細胞SiHa 活力和細胞凋亡的影響（A：對MAT2B 蛋白表達的影響；B：對細胞活力的影響；C：宮頸癌細胞SiHa 凋亡率；D：流式檢測宮頸癌細胞SiHa 凋亡；*P < 0.05）

Figure 4 Effect of silencing MAT2B on the viability and apoptosis of cervical cancer cells SiHa (A: Effect on MAT2B protein expression; B: Effect on cell viability; C: Cervical cancer cells SiHa apoptosis rate; D: Flow cytometry detects cervical cancer cells SiHa apoptosis;*< 0.05)

2.6 千金藤素調控 MAT2B 表達抑制宮頸癌細胞 SiHa 中 MAPK/ERK 信號通路

圖 6 顯示，與 NC 組比較，CEP 組 SiHa 細胞 p-p38 MAPK 和 p-ERK1/2蛋白的表達顯著下調；與 CEP+pcDNA 組比較，CEP+pcDNA-MAT2B 組 SiHa 細胞 p-p38 MAPK 和 p-ERK1/2 蛋白的表達顯著上調（< 0.05）。

圖 5 過表達MAT2B 逆轉千金藤素對宮頸癌細胞SiHa 活力和細胞凋亡的影響（A：對MAT2B 蛋白表達的影響；B：對細胞活力的影響；C：宮頸癌細胞SiHa 凋亡率；D：流式檢測宮頸癌細胞SiHa 凋亡）

Figure 5 Overexpression of MAT2B reverses the effect of cepharanthine on activity and apoptosis of cervical cancer cells (A: Effect on MAT2B protein expression; B: Effect on cell viability; C: Apoptosis rate of cervical cancer cells SiHa; D: Flow cytometry detects cervical cancer cells SiHa apoptosis)

3 討論

目前宮頸癌主要采用手術為主、放化療為輔的治療方案，然而晚期或復發(fā)性宮頸癌對常規(guī)治療無效的問題仍未得到解決。因此，有必要探索新的抗宮頸癌藥物，以改善患者預后和生活質量。

CEP 具有抗炎、免疫調節(jié)等多種生物活性，在日本已被廣泛應用于化學預防和治療包括白細胞減少癥在內的多種疾病，且并未出現(xiàn)嚴重的毒副作用。近年來CEP 的抗腫瘤作用被不斷揭示。例如，CEP 可降低卵巢癌細胞中cyclin A 和cyclin D 表達，增加 p21 表達，引起細胞周期 G1 期阻滯，誘導卵巢癌細胞凋亡[10]；CEP 還可誘導細胞產(chǎn)生活性氧，激活 c-Jun N 末端激酶（JNK），進而抑制人脈絡膜黑色素瘤細胞增殖，誘導細胞死亡[11]；此外，CEP 通過抑制 PI3K/Akt 信號通路可逆轉紫杉醇耐藥 A2780 細胞中 p 糖蛋白介導的多藥耐藥[12]。本研究結果證實，CEP 可抑制 SiHa 細胞增殖，促進細胞凋亡，并呈一定的劑量依賴性。PTX 是一線化療藥物，本研究結果顯示，CEP 對 SiHa 細胞的抗腫瘤作用與 PTX 的作用相一致。以上結果提示 CEP 是潛在的抗宮頸癌藥物。

MAT 又叫腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶，其在催化蛋氨酸和ATP 形成 SAM 中發(fā)揮關鍵作用。SAM 是一種重要的甲基供體，可將 DNA 甲基化，進而影響基因表達，是控制基因表達的重要開關。MAT2B 隸屬 MAT 家族，MAT2B 通過與MAT2A 二聚體結合降低 SAM 的i 值和蛋氨酸的m 值來調控 MAT II 的活性，從而影響體內 SAM 含量。既往研究表明，MAT2B 具有多種與腫瘤發(fā)生相關功能。在黑色素瘤中，MAT2B 基因敲低通過上調促凋亡基因表達和下調抗凋亡基因表達來抑制生長[13]；在肝癌和結腸癌中，MAT2B 與 G 蛋白偶聯(lián)受體激酶結合蛋白相互作用調節(jié) MEK1/ERK1/2 活性，從而促進細胞生長和腫瘤發(fā)生[14]。此外，MAT2B 通過靶向表皮生長因子受體和增殖細胞核抗原，促進骨肉瘤細胞增殖和抑制凋亡[15]。本研究顯示，CEP 呈濃度依賴性地抑制 SiHa 細胞中 MAT2B 表達。于是推測 CEP 通過下調 MAT2B 表達發(fā)揮抗宮頸癌作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制 MAT2B 表達可抑制 SiHa 細胞增殖，促進其凋亡，與 CEP 的抗宮頸癌作用相一致，過表達 MAT2B 可部分逆轉 CEP 對 SiHa 細胞增殖和凋亡的影響。以上結果提示，CEP 通過下調 MAT2B 表達進而抑制 SiHa 細胞增殖，誘導其凋亡。

圖 6 千金藤素調控MAT2B 表達抑制宮頸癌細胞SiHa 中MAPK/ERK 信號通路（A：對MAPK/ERK 信號通路蛋白表達的影響；B：MAPK/ERK 信號通路蛋白表達）

Figure 6 Cepharanthine regulates MAT2B expression to inhibit MAPK/ERK signaling pathway in cervical cancer cell SiHa

(A: Effect on MAPK/ERK signaling pathway protein expression; B: MAPK/ERK signaling pathway protein expression)

MAPK/ERK 信號通路在惡性腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，CEP 通過抑制 MAPK/ERK 信號通路活化進而抑制人結腸癌細胞裸鼠異體移植腫瘤的增殖[16]。本研究顯示，CEP 可抑制 SiHa 細胞中 p38 MAPK 和 ERK1/2 蛋白的磷酸化，抑制 MAPK/ERK 信號通路活化，而過表達 MAT2B 可部分逆轉 CEP 對 MAPK/ERK 信號通路的抑制作用。提示千金藤素下調 MAT2B 表達發(fā)揮抗宮頸癌作用與抑制 MAPK/ERK 信號通路有關。在后續(xù)研究中將探討千金藤素對宮頸癌細胞遷移侵襲能力的影響。

綜上所述，千金藤素通過下調 MAT2B 表達可抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制與抑制 MAPK/ERK 信號通路活化有關。本研究發(fā)現(xiàn)為千金藤素開發(fā)為宮頸癌臨床治療的藥物提供了理論依據(jù)。

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Effect of cepharanthine on proliferation and apoptosis of cervical cancer cells by regulating MAPK signaling pathway through MAT2B

YIN Yang-feng, JIANG Lei

Department of Pharmacy, Anhui NO.2 Provincial People's Hospital, Hefei 230001, China

To investigate the effects of cepharanthine on proliferation and apoptosis of human cervical cancer cells and its molecular mechanism.

SiHa cells were treated with cepharanthine at different concentrations. Cell viability was tested by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, apoptosis was examined by flow cytometry, and the expression of methionine adnosyltransferase 2B (MAT2B) was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) and Western blot, respectively. The optimal drug concentration was also screened. MAT2B small interfering RNA (si-MAT2B) was transfected into SiHa cells and then cell viability and apoptosis were measured. The MAT2B over-expression vector (pcDNA-MAT2B) was transfected into SiHa cells, and the viability, apoptosis, the expression level of phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase (p-p38 MAPK) and phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinases 1/2 (p-ERK1/2) were detected after treatment with cepharanthine.

At different times of treatment, with the increasing concentrations of cepharanthine, the viability of SiHa cells was gradually decreased, the apoptosis rate was gradually increased, and the expression level of MAT2B was gradually decreased. It was determined that the optimal concentration was 20 mg/L. After Si-MAT2B transfection, the proliferation of SiHa cells was significantly decreased, and the apoptosis rate was significantly increased (< 0.05). The expression of p-p38 MAPK and p-ERK1/2 protein in SiHa cells was significantly decreased after treatment with cepharanthine (< 0.05). After transfection with pcDNA-MAT2B and then treatment with quercetin, the viability of SiHa cells was significantly increased, the apoptosis rate was significantly decreased, and the expression of p-p38 MAPK and p-ERK1/2 protein was significantly increased (< 0.05) as compared with the group of pcDNA and quercetin.

Cepharanthine inhibits the proliferation and promotes apoptosis of cervical cancer cells by down-regulating MAT2B, and its mechanism is related to the inhibition of MAPK signaling pathway.

Cepharanthine; Cervical cancer; Methionine adnosyltransferase 2B; MAPK signaling pathway; Cell proliferation; Apoptosis

YIN Yang-feng, Email: 4576584@qq.com

尹楊峰，Email：4576584@qq.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.016

2019-10-11