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    干旱脅迫和復(fù)水處理后梭梭轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄組分析

    2020-04-16 03:43:54何江峰王力偉房永雨王蘊華劉紅葵
    華北農(nóng)學(xué)報 2020年1期
    關(guān)鍵詞:梭梭家族測序

    何江峰,王力偉,2,房永雨,王蘊華,王 朝,劉紅葵

    (1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

    梭梭(Haloxylonammodendron)屬黎科(Chenopodiaceae),為超旱生小喬木,呈高大灌木狀,植株高度一般在1~4 m,個別植株可高達8~10 m,亦稱鹽木、瑣瑣樹、梭梭柴。梭梭是肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)的寄主,肉蓯蓉是名貴的中藥材,在醫(yī)學(xué)上具有抗腫瘤、保肝、補腎、通便、抗老年癡呆、抗輻射等獨特功能,其寄生在梭梭的根端[1-2]。梭梭長期生長在荒漠環(huán)境中,形成了抗旱、抗風沙、耐高溫、耐寒、耐鹽堿和耐貧瘠等特性。因此,梭梭是荒漠化地區(qū)主要的防風固沙樹種,也可作為駱駝、羊適口性飼料,是荒漠草場中主要的木本飼料樹種之一[3]。梭梭具有重要的經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和飼用價值,是我國的二級保護植物,國內(nèi)外許多學(xué)者已從梭梭抗逆的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面進行了相關(guān)研究。

    梭梭的生存環(huán)境極其嚴酷,其主要分布地區(qū)常年干旱少雨,年降水量不足50 mm,相對濕度低于40%,蒸發(fā)量高于降水量的30~100倍,生存環(huán)境的極端溫度最高可達40 ℃以上,最低為-40 ℃以下,地表溫度可達70 ℃以上[4]。為了適應(yīng)極端環(huán)境,梭梭逐步形成了自身的極端抗旱機制,但梭梭的抗旱機理、抗旱遺傳機制和抗旱相關(guān)組學(xué)的研究相對較少,前人研究發(fā)現(xiàn),部分轉(zhuǎn)錄因子及與干旱脅迫相關(guān),例如,AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子(TINY、CBF1、Ptis、AtEBP、DREB1、DREB2)主要調(diào)節(jié)植物對低溫、干旱及高鹽[5]等的分子應(yīng)答反應(yīng);bZIP轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥基因組、豆科植物基因組、水稻基因組中參與對各種逆境脅迫的響應(yīng)[6-7];擬南芥中3個NAC基因(ANAC019、ANAC055和ANAC072)的過表達能夠顯著提高植株對干旱的抗性[8];許多NAC基因過表達能夠顯著提高水稻植株的脅迫抗性,卻不會減緩植株的正常生長[9-10];bHLH基因也參與水稻應(yīng)對干旱脅迫的分子調(diào)控過程[11]。在改良植物的抗逆分子育種中,導(dǎo)入或改良轉(zhuǎn)錄因子較導(dǎo)入或改良個別功能基因在增強植物抗逆性方面更為有效。因此,本研究主要對干旱脅迫和復(fù)水處理下梭梭的轉(zhuǎn)錄因子進行分析,挖掘與干旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,為闡明梭梭抗旱機理奠定理論基礎(chǔ),保護及開發(fā)我國抗逆植物基因資源。

    1 材料和方法

    1.1 材料及處理條件

    梭梭種子收集于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗。將梭梭種植在塑料花盆中(直徑:15 cm,高:18 cm),盆內(nèi)土壤均勻,濕度及質(zhì)量均一致。梭梭幼苗在植物培養(yǎng)室種植,室內(nèi)溫度為24/20 ℃(16 h光照 / 8 h 暗處理),相對濕度為30%,光子通量密度為350 μmol/(m2·s)。本研究隨機單株種植25盆梭梭幼苗,包括1個正常澆水組(對照組,CK)、干旱脅迫組(土壤相對含水量為30%~45%,LMS;土壤相對含水量為20%~25%,MWS;土壤相對含水量為10%~15%,SWS)和旱后復(fù)水處理組(土壤相對含水量為在重度水分脅迫組上增加10%~15%,RSWS)。干旱脅迫組、復(fù)水處理組和對照組的種植均設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù),每天在固定時間測質(zhì)量、控水、補水并記錄待幼苗生長90 d之后,分別從CK、LWS、MWS、SWS 以及重度脅迫90 d之后復(fù)水處理7 d的RSWS的植株上采集等量的根、莖和葉混合,液氮速凍,置于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆茫崛「魈幚淼目俁NA。

    1.2 總 RNA 提取

    材料總RNA的提取采用 RNAprep Pure Plant Plus KIT(DP441,TIANGEN北京生化科技有限公司)試劑盒。用 DNase酶(2212,大連寶生物工程有限公司)對樣品中的 gDNA 進行消化處理。RNA完整性和純度質(zhì)量經(jīng)1.2%非變性瓊脂糖凝膠電泳和 Agilent 2100 分析系統(tǒng)檢測。

    1.3 RNA測序和分析方法

    總RNA提取按照文獻[12]的方法,利用 Solexa/Illumina進行測序及深圳華大基因公司的Illumina系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)分析。RPKM值用于基因表達水平的分析,利用Cluster軟件[13],以歐氏距離為距離矩陣計算公式,對基因和試驗條件同時進行等級聚類分析,聚類結(jié)果用Java Treeview顯示,利用WEGO軟件對差異基因做GO功能分類統(tǒng)計[14],pathway顯著性富集分析以KEGG pathway為單位,應(yīng)用超幾何檢驗,找出與整個基因組相比后差異表達基因中顯著性富集的pathway基因和基因組的代謝途徑[15]。

    1.4 de novo 拼接及序列分析

    用Trinity[16]做轉(zhuǎn)錄組 de novo 組裝,并通過 reads overlap 關(guān)系得到 Contig。然后,將 clean reads 比對回Contig,通過paired-end reads 能確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同 Contig 以及這些 Contig 之間的距離,Trinity 將 Contig 連在一起,最后得到兩端不能再延長的序列,即為 Unigene。組裝得到的 Unigene,首先使用 Tgicl 將其去冗余并進一步拼接,然后再對這些序列進行同源轉(zhuǎn)錄本聚類,最終得到非冗余 Unigene。用 Tophat v2.0.9(Broad Institute)將拼接得到的非冗余 Unigene 與已公布的同種屬基因組信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比對、注釋,用已獲取各測序樣本中包含的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因信息。

    1.5 差異表達基因的篩選

    樣本中 Unigene 的表達量以公式化校正的 FPKM(Fragments per kb per million fragments)[17]值衡量。2個樣本間差異表達基因(Differential expression genes,DEGs)的篩選及分析使用DEGSeq R package軟件,以FDR(False discovery rate)≤0.001,且Log2(fold change,F(xiàn)C)≥1作為篩選閾值進行差異表達基因的篩選。

    1.6 差異表達基因 Real-time PCR 驗證

    從測序結(jié)果中隨機挑選 9 個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因,用熒光實時定量 PCR 法驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的有效性和準確性。引物設(shè)計用 Primer 5 軟件,序列見表1。以18S為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt計算,并校正目標基因在不同處理下的表達量,每個基因3次生物學(xué)重復(fù)。10 μL反應(yīng)體系中包括5 μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,TaKaRa Clontech,Japan),5 μmol/L上游引物,5 μmol/L下游引物和20 ng 模板cDNA。所有反應(yīng)體系加樣都在96孔板進行,并在Lightcycle-480(羅氏)熒光定量PCR儀上完成,反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;后按95 ℃ 15 s,55 ℃ 2 min,72 ℃ 1 min,共40個循環(huán);72 ℃延伸2 min。18S基因為擴增體系的內(nèi)參基因,擴增產(chǎn)物的表達水平按 2-ΔΔCt方法計算[18]。每個樣品都有3次技術(shù)重復(fù),結(jié)果都以平均值±標準誤(s)(n= 3)計算。

    表1 實時定量PCR引物

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    以梭梭幼苗為材料,對CK、LWS、MWS、SWS和RSWS處理組進行轉(zhuǎn)錄組測序和表達譜分析。對測序數(shù)據(jù)進行拼接、比對和整理,經(jīng)de novo 拼接、去冗余、同源轉(zhuǎn)錄本聚類后,最終在CK、LWS、MWS、SWS和RSWS 5個組中得到74 641條非冗余Unigene,平均長度780 bp,N50長度1 537 bp。 將CK、LWS、MWS、SWS和RSWS混合樣本拼接得到的非冗余Unigene進行比對、注釋,共檢測到56個轉(zhuǎn)錄因子家族,1 307個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因;在CK、LWS、MWS、SWS和RSWS組分別檢索到 934,978,994,1 003,991 條轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。LWS、MWS、SWS分別與CK組相比,RSWS與SWS相比,差異表達轉(zhuǎn)錄因子均以下調(diào)表達方式為主,CK-vs-SWS組中下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目最多,達112條,約占該組差異表達轉(zhuǎn)錄因子編碼基因總數(shù)的59.3%(表2)。

    表2 差異表達轉(zhuǎn)錄因子

    2.2 差異表達轉(zhuǎn)錄因子家族統(tǒng)計分析

    獲得4個對比組轉(zhuǎn)錄因子基本數(shù)量信息后,進一步統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)錄因子家族及其包含成員的數(shù)量關(guān)系。LWS、MWS、SWS分別與CK組對比,RSWS與SWS相比,表3分析表明,其中,AP2-EREBP、WRKY、bHLH、MYB、NAC和ABI3VP1 家族富集的DEGs 超過該組差異表達基因總數(shù)的50%以上,其中AP2-EREBP、WRKY、MYB和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子較多。由圖1-A-C結(jié)果顯示,AP2-EREBP家族包含的下調(diào)差異表達基因,分別為6個(CK-vs-LWS)、17個(CK-vs-MWS)和 16個(CK-vs-SWS)DEGs,約占各組DEGs總數(shù)的75%,81%,59%;WRKY家族包含的下調(diào)差異表達基因,分別為6個(CK-vs-LWS)、12個(CKvs-MWS)和 2個(CK-vs-SWS)DEGs,約占各組DEGs總數(shù)的100%,100%,33%;bHLH家族包含的下調(diào)差異表達基因,分別為5個(CK-vs-LWS)、4個(CK-vs-MWS)和 16 個(CK-vs-SWS)DEGs,約占各組DEGs總數(shù)的100%,57%,84%;MYB家族包含的下調(diào)差異表達基因,分別為5個(CK-vs-LWS)、9個(CK-vs-MWS)和 10 個(CK-vs-SWS),約占各組DEGs總數(shù)的100%,64%,45%。圖1-D結(jié)果顯示,AP2-EREBP家族、NAC家族和WRKY家族包含的上調(diào)差異表達基因分別占各自DEGs總數(shù)的67%,86%,75%。以上表達規(guī)律顯示,MYB和WRKY家族基因在LWS組中沒有上調(diào)表達,但在MWS和SWS中其上調(diào)表達數(shù)逐漸增加。綜合說明,RSWS組中偏向通過增加 AP2-EREBP、NAC家族和WRKY家族編碼基因的上調(diào)表達數(shù)來實現(xiàn)梭梭幼苗對水分刺激的應(yīng)答調(diào)節(jié);而干旱組(LWS、 MWS和 SWS)更偏向于下調(diào)AP2-EREBP和bHLH 的DEGs數(shù)量來實現(xiàn)其對干旱脅迫的響應(yīng)。

    表3 干旱和復(fù)水組各轉(zhuǎn)錄因子家族中的基因表達數(shù)

    2.3 差異表達轉(zhuǎn)錄因子表達量分析

    從4個對比組中挑選了表達量(FC)變化幅度最大的10個上調(diào)和下調(diào)基因,并對這些基因的表達規(guī)律進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明:差異表達基因Tify(CL5087)和NAC(Unigene28108)在干旱脅迫組(LWS、MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均上調(diào)表達,表達量(FC)變幅為1.23~12.24,2.89~11.37;AP2-EREBP(Unigene2016)、AP2-EREBP(Unigene442)和AP2-EREBP(Unigene160)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)中下調(diào),在復(fù)水組(RSWS)中又上調(diào)表達。表達量變幅為-4.65~12.22,-8.31~7.38,-6.99~6.85。bHLH(CL2529)和E2F-DP(CL4870)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)中下調(diào)表達,變化幅度分別為-14.17~-3.73,-11.89~-4.56;在復(fù)水組中卻不表達。RWP-RK(CL8167)、DBP(CL6537),在干旱脅迫組(LWS、MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均上調(diào)表達。BZIP(Unigene23554)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均下調(diào)表達。綜合統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,AP2-EREBP、NAC、E2F-DP、bHLH 和BZIP等5類轉(zhuǎn)錄因子對干旱和水分刺激應(yīng)答顯著(表 4)。

    A.CK-vs-LWS的差異表達基因; B.CK-vs-MWS的差異表達基因;C.CK-vs-SWS的差異表達基因; D.RSWS-vs-SWS的差異表達基因。

    表4 對比組差異表達轉(zhuǎn)錄因子表達量分析

    注:Log2(FC)≥1時,基因表達顯著。

    Note:Gene expression is significant when Log2(FC)≥1.

    2.4 Real-time PCR 驗證

    從測序數(shù)據(jù)中隨機選取了9個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因,用Real-time PCR 方法驗證測序數(shù)據(jù)的有效性。圖2顯示,干旱和水分刺激應(yīng)答相關(guān)的AP2-EREBP、WRKY、bHLH、MYB、C2C2-Dof、RWP-RK、NAC、C2H2和ABI3VP1編碼基因在處理前后表達量變化均極顯著。干旱脅迫組和復(fù)水組測序數(shù)據(jù)與用熒光定量PCR 法得到的基因表達數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分別為0.947 8(P<0.01),0.967 2(P<0.01),說明干旱脅迫和復(fù)水處理后產(chǎn)生的差異表達基因數(shù)據(jù)有效。

    均值±s,樣本均為3個重復(fù);不同大寫字母表示統(tǒng)計結(jié)果在1%水平上有顯著差異。

    3 討論與結(jié)論

    本研究通過對干旱脅迫和復(fù)水處理下梭梭轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的分子機理進行研究,發(fā)掘其中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,對培育抗旱能力強、水分利用效率高的新作物品種具有重要的意義。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)受脅迫刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生,并將信號傳遞、放大,能夠通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率從多個層面降低脅迫對植物的傷害,對植物在逆境下的生長發(fā)育起到了至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用,尤其是AP2-EREBP、 E2F/DP、MYB、NAC、WRKY、bHLH和BZIP等家族,是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子,對干旱脅迫響應(yīng)和水分刺激應(yīng)答發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[19-23]。本試驗測序結(jié)果中,各對比組中 AP2-EREBP、MYB、bHLH、NAC、WRKY和ABI3VP1等轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的數(shù)量占主要比例,說明這幾類轉(zhuǎn)錄因子對梭梭干旱脅迫和水分刺激應(yīng)答調(diào)控作用極顯著,其中,AP2-EREBP、WRKY、MYB和bHLH是所有56個家族中差異表達轉(zhuǎn)錄因子成員最多的蛋白家族。AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子要調(diào)節(jié)植物對低溫、干旱及高鹽[23]等的分子應(yīng)答反應(yīng)。本研究中 AP2-EREBP是干旱和復(fù)水處理下數(shù)量豐富、表達量變化最顯著的一類轉(zhuǎn)錄因子,且AP2-EREBP(Unigene2016)、AP2-EREBP(Unigene442)和AP2-EREBP(Unigene160),在干旱脅迫下顯著下調(diào),而在復(fù)水組中顯著上調(diào),與 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子類似,干旱脅迫處理下誘導(dǎo)更多的下調(diào)ERF轉(zhuǎn)錄因子表達,說明這類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控作用的模式可能與bHLH類似。本研究結(jié)果還表明,干旱處理和復(fù)水處理后下調(diào)的bHLH編碼基因數(shù)量均大于上調(diào)數(shù),推測bHLH編碼基因主要通過下調(diào)其表達調(diào)控機體應(yīng)答脅迫過程。張子佳等[11]對水稻 22 個bHLH基因在PEG 和 ABA 脅迫下的表達譜進行了分析,結(jié)果表明,其中一些bHLH基因在響應(yīng)干旱脅迫過程中受ABA負調(diào)控。此外,不同的bHLH基因參與應(yīng)答環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)方式不同,表明參與 PEG 和 ABA 脅迫應(yīng)答的bHLH基因具有不同的分子路徑或模式。因此,梭梭中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的進一步研究已在該課題組將繼續(xù)進行。

    Liao等[24]從研究的大豆基因中獲得了 156 個 MYB 家族基因,利用酵母單雜交的方法篩選出了40個左右與逆境相關(guān)的基因,將這些基因轉(zhuǎn)入擬南芥進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) GmMYB177 提高了擬南芥耐旱性。丁震乾等[25]在陸地棉中克隆了 MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因GhRAX3,發(fā)現(xiàn)其表達在干旱脅迫 0.5 h 后即表現(xiàn)為顯著上調(diào),且 48 h 內(nèi)持續(xù)高表達水平;而抑制GhRAX3的表達,則加快了棉花植株的失水率、細胞質(zhì)膜過氧化和細胞受損程度,降低了棉花對干旱脅迫的耐受性。目前,發(fā)現(xiàn)的大多數(shù) MYB 類轉(zhuǎn)錄因子基因均表現(xiàn)為提高植物抗旱能力,但亦有例外,如 Zhou 等[26]的研究任務(wù),將JcMYB001轉(zhuǎn)入擬南芥后,其過表達反而增加了擬南芥對干旱的敏感性。本研究中的MYB轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫組與對照組相比,其下調(diào)差異表達基因較其他轉(zhuǎn)錄因子多,MYB家族中上調(diào)基因數(shù)隨著干旱脅迫程度的增加而增加。說明本研究結(jié)果也證實了MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫具有正調(diào)控和負調(diào)控性。

    綜合以上結(jié)果推測,發(fā)揮主要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族或成員間可能存在一定的共表達性或相互關(guān)聯(lián)性,各轉(zhuǎn)錄因子間協(xié)同作用對干旱和水分刺激做出精細應(yīng)答調(diào)控。植物對干旱脅迫和水分刺激應(yīng)答過程受眾多分子和細胞通路的調(diào)控[27]。轉(zhuǎn)錄因子能特異與順式作用元件結(jié)合激活或抑制下游靶基因表達,參與脅迫信號傳遞網(wǎng)絡(luò),其“閥門作用”的重要性不言而喻。本研究借助高通量測序技術(shù),從整體層面概要性的分析了干旱和干旱后復(fù)水處理下梭梭幼苗轉(zhuǎn)錄因子種類及初步的表達規(guī)律,結(jié)果將為干旱脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、有目的地篩選關(guān)鍵調(diào)控基因和分子設(shè)計育種等研究提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

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