HPLC法檢測(cè)艾葉中傘形花內(nèi)酯含量

姚 武，羅 輝

HPLC法檢測(cè)艾葉中傘形花內(nèi)酯含量

*姚 武1，*羅 輝2

(1. 黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽，黃山 245041；2. 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009）

本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用HPLC方法分析了艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量。采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯在0.1~2.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=74.3869-0.6815(= 0.9998)，平均回收率為99.5%，RSD為1.06%。本法操作簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確，可以為建立和完善中藥材艾葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了借鑒。

艾葉；傘形花內(nèi)酯；高效液相色譜；檢測(cè)

引言

艾葉()為菊科蒿屬植物艾（et Vant）的干燥葉，夏季花未開(kāi)時(shí)采摘，除去雜質(zhì)，曬干即得，它是我國(guó)臨床常用中藥材之一[1]。艾葉性溫，味辛、苦，有較好的散寒止痛、溫經(jīng)止血的作用[2]。現(xiàn)代藥理研究也表明艾葉具有抗菌抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)靜、免疫、護(hù)肝利膽及補(bǔ)體激活等作用[3]。

傘形花內(nèi)酯又名傘形酮、7-羥基香豆素，屬于酚類(lèi)物質(zhì)，能夠與血清蛋白、酶等生物大分子結(jié)合，具有較強(qiáng)的抗菌、消炎、防止肝纖維化等功能[4-6]，其廣泛存在于多種中草藥植物中[7-12]。根據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，艾葉中也含有傘形花內(nèi)酯成分[13]。

我國(guó)2015版藥典一部，艾葉的含量測(cè)定項(xiàng)下，只規(guī)定了氣相色譜法測(cè)定桉精油的含量，沒(méi)有規(guī)定艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量質(zhì)量指標(biāo)。有關(guān)艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量分析也尚未見(jiàn)報(bào)道。HPLC法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，它是中藥材成分含量分析的常用分析方法[14-15]。本文研究了HPLC法測(cè)定艾葉中傘形花內(nèi)酯含量的方法，為建立和完善中藥材艾葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

艾葉，采摘于安徽省屯溪地區(qū)，經(jīng)黃山學(xué)院植物學(xué)張慧沖副教授鑒定。傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥ 98%），購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司。甲醇、冰醋酸、四氫呋喃等試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京久盛康科技有限公司。Agilent 1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1），水-四氫呋喃用冰醋酸調(diào)pH = 2.70；柱溫：室溫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm。

1.3 溶液制備

精密稱(chēng)取傘形花內(nèi)酯對(duì)照品5.0 mg，置50 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，定容，搖勻，得濃度為100 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，于冰箱中保存?zhèn)溆?。?duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇適當(dāng)稀釋后作為對(duì)照品溶液使用。

取適量艾葉，去除桿和莖，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩，在干燥箱中70 ℃烘10 h。稱(chēng)取2.0000 g艾葉粉末于磨口錐形瓶中，用25 mL移液管向其中加入50 mL甲醇，振蕩，于55 ℃超聲（頻率45 kHz，功率100%）45 min，抽濾；濾液置于50 mL容量瓶中，用膠頭滴管加甲醇至刻度，搖勻，再用0.45 μm（有機(jī)系）微孔濾膜過(guò)濾，得綠色澄清液體，得供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將傘形花內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋到適當(dāng)濃度，在250~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)做紫外掃描，結(jié)果如圖1所示，在325 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇325 nm作為HPLC紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 傘形花內(nèi)酯對(duì)照品溶液紫外掃描圖

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

高效液相色譜實(shí)驗(yàn)中，流動(dòng)相對(duì)分離起著極其重要的作用，流動(dòng)相的選擇是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)流動(dòng)相的pH值、組成配比和流速進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 流動(dòng)相pH值的影響

固定流動(dòng)相甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1）的比例，用冰醋酸調(diào)節(jié)水-四氫呋喃的pH值為2.40、2.60、2.70、2.80、3.00、3.20，再加入甲醇配成流動(dòng)相。進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值為2.70時(shí)分離效果好，保留時(shí)間適宜，信號(hào)強(qiáng)度較大。

2.2.2 流動(dòng)相配比的影響

固定流動(dòng)相中甲醇和水的組成，研究流動(dòng)相中不同四氫呋喃的量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。所選用流動(dòng)相的組成分別為：（A）甲醇-水-四氫呋喃（4:15:0）、（B）甲醇-水-四氫呋喃（4:15:0.5），（C）甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1），（D）甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1.5）。pH值固定為2.70，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min。結(jié)果顯示，使用A和B流動(dòng)相時(shí)，傘形花內(nèi)酯對(duì)照品保留時(shí)間較長(zhǎng)，樣品中傘形花內(nèi)酯信號(hào)很弱。使用D流動(dòng)相時(shí)，傘形花內(nèi)酯信號(hào)較小，與其它成分的分離度較低。選用C流動(dòng)相時(shí)，傘形花內(nèi)酯信號(hào)較好，與其它成分的分離度也較高。固選用C流動(dòng)相作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.2.3 流動(dòng)相流速的影響

固定流動(dòng)相甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1）的配比，pH值為2.70，進(jìn)樣量為20 μL，流速分別為0.80、1.00、1.20 mL/min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用流速1.20 mL/min時(shí)則保留時(shí)間縮短，但信號(hào)不能很好地分離；當(dāng)采用流速0.80 mL/min時(shí)，分離效果較好，但是信號(hào)強(qiáng)度比較小；而當(dāng)選用流速1.00 mL/min時(shí)，保留時(shí)間較為合適，分離效果好，信號(hào)強(qiáng)度也較強(qiáng)。故選擇1.00 mL/min的流速。

綜上所述，由分離效果、保留時(shí)間、信號(hào)強(qiáng)度等方面綜合分析，最佳實(shí)驗(yàn)條件為：流動(dòng)相的組成為甲醇-水-四氫呋喃（4:15:1），pH值為2.70，流速為1.00 mL/min。傘形花內(nèi)酯對(duì)照品溶液和艾葉供試品溶液的色譜圖分別如圖2（A）和圖2（B）所示。

圖2 傘形花內(nèi)酯對(duì)照品溶液（A）和艾葉供試品溶液（B）的色譜圖

2.3 線性關(guān)系

用對(duì)照品儲(chǔ)備液配制得到濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密量取該對(duì)照品溶液0.1、0.3 、0.5、1.0 、1.5、2.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL。以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程= 74.3869-0.6815 (= 0.9998)，傘形花內(nèi)酯濃度在0.1~2.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，如圖3所示。

圖3 傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取上述1.0 μg/mL對(duì)照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)得傘形花內(nèi)酯峰面積的RSD = 0.69%，精密度良好，如表1所示。

表1 傘形花內(nèi)酯精密度實(shí)驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)色譜條件下，1.0 μg/mL對(duì)照品溶液分別放置1、2、3、4、5 h進(jìn)樣，每次20 μL，測(cè)定峰面積，峰面積的RSD為0.95%，表明對(duì)照品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。所得穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 傘形花內(nèi)酯的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.6 樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和含量測(cè)定

分別稱(chēng)取3份2.0000 g已干燥艾葉粉末，按實(shí)驗(yàn)方法制備3份供試品溶液。在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，每次20 μL，峰面積的RSD為1.65%，重復(fù)性良好，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品溶液的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中3個(gè)供試品溶液的平均峰面積代入線性回歸方程，計(jì)算得供試品溶液中傘形花內(nèi)酯的濃度C = 0.995 μg/mL，質(zhì)量為49.75 μg，艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量為0.0025%。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別取上述2.3中供試品溶液5.0 mL于3個(gè)不同的10 mL容量瓶中，再分別向其中加入0.8、1.0、1.2 mL 5 μg/mL的對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后用0.45 μm（有機(jī)系）微孔濾膜過(guò)濾。按上述色譜條件進(jìn)樣，每次20 μL，按照樣品含量測(cè)定方法測(cè)定傘形花內(nèi)酯的平均加樣回收率，結(jié)果如表4所示。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

平均加樣回收率為99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%，由此可知分析方法可行，測(cè)量準(zhǔn)確度高。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量，研究了不同流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相組成、流動(dòng)相流速等因素的影響。結(jié)果表明，此種方法具有較好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可以用于艾葉中傘形花內(nèi)酯的含量測(cè)定，為建立和完善藥材用艾葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了借鑒。

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DETERMINATION OF UMBELLIFERONE INHPLC

*YAO Wu1，*LUO Hui2

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Huangshan University, Huangshan, Anhui 245041, China; 2. Health Science Center, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

In this paper, the content of umbelliferone in folium artemisiae argyi was firstly detected by HPLC method. Agilent TC-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used with a methanol-water-tetrahydrofuran (4:15:1) solution as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was 325 nm. The concentration of umbelliferone showed good linear relationship with the peak area in the range of 0.1~2.0 μg/mL. The regression equation was A=74.3869-0.6815 (= 0.9998). The average recovery rate was 99.5% (RSD = 1.06%). This method is simple, rapid and accurate, and provides a reference for the establishment and improvement of the quality standard of folium artemisiae argyi.

; umbelliferone; HPLC; determination

1674-8085(2020)01-0021-04

O657.7

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.01.005

2019-12-12；

2019-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460488)；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（11040606M41）；安徽省高校自然科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（KJ2016A683）

*姚 武(1968-)，男，安徽屯溪人，教授，主要從事藥物化學(xué)分析研究(Email:yaowu92@163.com);

*羅 輝(1971-)，男，江西吉水人，副教授，碩士，主要從事生物化學(xué)教學(xué)科研(E-mail: luohui9898@163.com).