爵床提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究

梁生林，鐘衛(wèi)華，李慶耀，褚洪標(biāo)，周細(xì)根

藥物與試劑

爵床提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究

*梁生林1，鐘衛(wèi)華2，李慶耀1，褚洪標(biāo)1，周細(xì)根1

(1．井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西 吉安 343009；2．井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000)

探討爵床提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用。采用致炎劑二甲苯引起小鼠耳腫脹、新鮮蛋清引起大鼠足跖腫脹2種急性炎癥模型以及棉球引起大鼠肉芽腫慢性炎癥模型，研究爵床提取物灌胃給藥對急慢性炎癥的作用。采用熱板法、醋酸扭體法和甲醛法致痛，研究爵床提取物灌胃給藥的鎮(zhèn)痛作用。與純化水對照組相比，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組對致炎劑二甲苯所引起的小鼠耳廓腫脹抑制顯著（< 0.01，< 0.05），對蛋清所引起的大鼠足跖腫脹抑制顯著（< 0.01），對大鼠棉球肉芽腫抑制顯著（< 0.01）。爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組給藥后對熱板所引起的小鼠痛閾值明顯提高，與純化水對照組和自身給藥前比較差異明顯（< 0.01，< 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組對致痛劑醋酸所引起的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少，也明顯抑制甲醛所引起的早期（0~5 min）和晚期（15~30 min）小鼠足痛反應(yīng)，與純化水對照組比較差異顯著（< 0.01）。爵床醇提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用比水提取物強(qiáng)（< 0.01，< 0.05）。爵床提取物灌胃給藥具有一定抗炎、鎮(zhèn)痛作用，且醇提取物強(qiáng)于水提取物。

爵床；醇提取物和水提取物；抗炎；鎮(zhèn)痛

爵床[(Liun.) Nees]是一種常見中草藥，它是爵床科植物爵床的干燥全草，主要分布于我國西南部和南部各省，曾經(jīng)收載于1977年版《中國藥典》一部[1]。具清熱解毒、消除疳積的功效作用[2-4]。爵床主要含木脂素類[5-8]、黃酮類[7-9]等化合物，具有抗腫瘤[5,6,9, 10-13]、抗病毒[14]、抗菌[15-16]、抗血小板凝集[17]等作用。在前期研究中課題組發(fā)現(xiàn)，腹腔注射爵床水煎劑對化學(xué)刺激物二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，對熱板引起的小鼠疼痛也有明顯鎮(zhèn)痛作用[18]。但爵床提取物灌胃給藥在抗炎鎮(zhèn)痛方面是否有作用，不同提取物在抗炎鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度方面是否有明顯不同，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討爵床醇提取物和水提取物灌胃給藥對致炎劑二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹、蛋清引起的大鼠足跖腫脹及棉球致炎的抗炎作用，以及小鼠熱板引起的疼痛、醋酸引起的扭體及甲醛法致痛的鎮(zhèn)痛作用，其目的是為爵床的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級昆明種小鼠，體重18~22 g，雄雌兼有；清潔級SD大鼠，體重180~220 g，雄雌各一半，它們都是由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 藥物與試劑

爵床采于江西省吉安市，經(jīng)井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)系周秋貴副教授鑒定為爵床科植物爵床[(Liun.) Nees]；阿司匹林腸溶片，規(guī)格：25 mg，批號：130525，石家莊康力藥業(yè)有限公司；鹽酸嗎啡注射液，規(guī)格：1mL:10 mg，批號：130806-2，東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠；二甲苯，批號：20060201，中國上海試劑一廠；戊巴比妥鈉，批號：WS20110112，上海西唐生物科技有限公司；36%醋酸，上海松江佘山化工廠；甲醛為市售分析純試劑。

1.3 儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-A循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；YLS-25A電動耳腫打耳器，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；PV-200足腫容量測量儀，成都泰盟軟件有限公司；RB-200智能熱板儀，成都泰盟軟件有限公司；電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海新苗醫(yī)療器材制造有限公司。

2 方法

2.1 爵床提取物的制備

2.1.1 醇提取物的制備

取干燥的爵床粗粉225 g，用濃度為80%乙醇浸泡24 h后用回流裝置在水浴中加熱回流提取3次，第1次回流1 h，后2次各0.5 h，把3次回流提取液合并，回收乙醇，蒸干至干浸膏，計(jì)入其重量并換算每克干浸膏相當(dāng)原藥材的重量，貯存?zhèn)溆?。用時(shí)用純化水配成所需濃度。

2.1.2 水提取物的制備[19]

把225 g切成小段的干燥爵床用12倍純化水浸泡0.5 h，煎煮1 h，過濾，第2、3次各加10倍量純化水煎煮0.5 h，過濾，把3次煎出液合并，靜置除渣，濃縮至流浸膏，計(jì)入其體積并換算每毫升流浸膏相當(dāng)原藥材的重量，貯存?zhèn)溆?。用時(shí)用純化水配成所需濃度。

2.2 爵床提取物的抗炎實(shí)驗(yàn)

2.2.1 耳腫法[20-21]

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將72只雄雌各半昆明種小鼠按體重和性別隨機(jī)均分為6組：純化水對照組，阿司匹林陽性組（0.5 g/kg），爵床醇提取物高、低劑量（7.5 g生藥/kg、3.75 g生藥/kg）組，爵床水提取物高、低劑量（7.5 g生藥/kg、3.75 g生藥/kg）組。小鼠均采用灌胃給藥，灌服的容量為10 mL/kg，連續(xù)灌胃5 d，1次/d。最后1次灌胃給藥后1 h給每只小鼠左耳廓兩面均勻涂擦致炎劑二甲苯0.05 mL引起耳廓腫脹，右耳廓不涂擦作對照。0.5 h后頸椎脫臼法把小鼠處死，用剪刀沿著耳根部把雙耳剪下，用直徑為8 mm的電動耳腫打耳器在左右耳相同的位置分別打下圓形耳片，精確稱重，計(jì)算耳腫脹度和腫脹抑制率。耳腫脹度＝左耳片重量－右耳片重量。耳腫脹抑制率（%）=（對照組耳腫脹度－給藥組耳腫脹度）/對照組耳腫脹度 × 100%。

2.2.2 足腫法[20-21]

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將60只雄雌各半SD大鼠按體重和性別隨機(jī)均分為6組：純化水對照組，阿司匹林陽性組（0.5 g/kg），爵床醇提取物高、低劑量（7.5 g生藥/kg、3.75 g生藥/kg）組，爵床水提取物高、低劑量（7.5 g生藥/kg、3.75 g生藥/kg）組。大鼠均采用灌胃給藥，灌服的容量為10 mL/kg，連續(xù)灌胃5 d，1次/d。最后1次灌胃給藥后1 h，給每只大鼠左后足跖皮下注射新鮮配制的0.1 mL 10%蛋清生理鹽水溶液致炎，用PV-200足腫容量測量儀分別測定各鼠致炎前足跖容量及致炎后第1、2、4、6 h的足跖容量，記錄結(jié)果，并計(jì)算足腫脹率（%）。足腫脹率（%）＝（致炎后足跖容量－致炎前足跖容量）/致炎前足跖容量 × 100%。

2.2.3 棉球法[20-21]

大鼠分組組數(shù)和方法與“2.2.2”項(xiàng)相同。腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，在大鼠左右兩側(cè)蹊部先用碘伏消毒后用酒精脫碘后，用手術(shù)刀各切長約1 cm的切口，然后把重20 mg的滅菌棉球（10 g/L氨芐西林液浸泡，烘干）用眼科鑷從切口處塞入大鼠皮下，再將切口縫合。第2 d開始灌胃給藥，灌服的劑量與“2.2.2”項(xiàng)相同，連續(xù)灌服7 d。第8 d頸椎脫臼法處死大鼠，將原切口挑開，把棉球及其周圍結(jié)締組織一并取出，將脂肪組織剔除，放于恒溫電熱干燥箱，把溫度調(diào)到60 ℃干燥24 h，稱重。將稱得的重量減去棉球原重量即得肉芽腫重量，計(jì)算肉芽腫抑制率。肉芽腫抑制率（%）＝（對照組肉芽腫重量－給藥組肉芽腫重量）/對照組肉芽腫重量 × 100%。

2.3 爵床提取物的鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.3.1 熱板法[19-20]

熱板加熱至（55.0 ± 0.1）℃，記錄小鼠從放入熱板至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)所需的時(shí)間（s），以此時(shí)間作為該鼠的痛閾值，剔除痛閾值小于5 s或大于30 s以及跳躍者。根據(jù)體重將72只篩選合格的雌性小鼠隨機(jī)均分為6組，除了陽性對照組由阿司匹林改為鹽酸嗎啡（0.02 g/kg）外，剩下各組與“2.2.1”項(xiàng)相同。每鼠各測2次正常痛閾值，2次測定間隔時(shí)間為10 min，取2次測得數(shù)值的平均數(shù)作為每鼠給藥前正常痛閾值。陽性對照組給藥為皮下注射嗎啡溶液2 d，其余各組均灌胃給藥，給藥劑量和時(shí)間均與“2.2.1”項(xiàng)相同。最后1次給藥后30、60、90、120 min各測定小鼠的痛閾值，如果放入熱板60 s仍無舔后足，馬上取出小鼠，此小鼠的痛閾值就按60 s來計(jì)算。

2.3.2 醋酸扭體法[19-20]

小鼠分組及給藥均與“2.2.1”項(xiàng)相同。最后1次灌胃給藥后1 h，每只小鼠均用0.6%新鮮配制的醋酸0.2 mL腹腔進(jìn)行注射。觀察并記錄小鼠在注射醋酸后15 min內(nèi)因疼痛而出現(xiàn)的扭體反應(yīng)的次數(shù)，并計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（對照組扭體反應(yīng)次數(shù)－給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)）/對照組扭體反應(yīng)次數(shù) × 100%。

2.3.3 甲醛法[22]

72只雄雌各半小鼠，按體重和性別隨機(jī)均分為6組，組別及給藥與 “2.3.1”項(xiàng)相同。末次給藥后1 h，每鼠右后足背皮下注射0.92%甲醛（生理鹽水配制）20 μL。將小鼠舔、咬右后爪的時(shí)間長度作為疼痛反應(yīng)的指標(biāo)。觀察并記錄0~5 min，15~30 min反應(yīng)時(shí)間。抑制率（%）=（對照組平均反應(yīng)時(shí)間-給藥組平均反應(yīng)時(shí)間）/對照組平均反應(yīng)時(shí)間 × 100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

與純化水對照組相比較，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組對致炎劑二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹抑制均明顯（< 0.01，< 0.05），且耳廓腫脹抑制率與劑量呈正相關(guān)；阿司匹林組對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹也抑制顯著（< 0.01）。爵床醇提取物高、低劑量組與阿司匹林陽性對照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。爵床醇提取物與水提取物各對應(yīng)劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），顯示醇提取物作用比水提取物強(qiáng)。結(jié)果見表1。

表1 爵床提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響（, n = 12）

注：與純化水組比較，*< 0.05，**< 0.01；與阿司匹林組比較，#> 0.05；與水提取物組比較，&< 0.05

3.2 對蛋清致大鼠足跖腫脹的影響

與純化水對照組相比較，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組以及阿司匹林組對蛋清所引起的大鼠足跖腫脹抑制均顯著(< 0.01)。爵床醇提取物低劑量組給藥后4、6 h與相同劑量的水提取物組相比較，差異顯著(< 0.01，< 0.05)。結(jié)果見表2。

表2 爵床提取物對蛋清致大鼠足跖腫脹的影響(,n = 10)

注：與純化水組比較，**< 0.01；與水提取物組比較，&< 0.05，&&< 0.01

3.3 對大鼠棉球肉芽腫的影響

與純化水對照組相比較，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組和阿司匹林組對大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥抑制作用均顯著（< 0.01）。結(jié)果見表3。

表3 爵床提取物對大鼠棉球肉芽腫的作用（, n =10）

注：與純化水組比較，**< 0.01

3.4 對熱板法致小鼠疼痛的影響

與純化水對照組相比較，給藥前各組痛閾值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（> 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組，灌胃給藥后30、60、90、120 min對熱板引起的小鼠痛閾值具明顯提高(< 0.01，< 0.05），且具劑量依賴性；嗎啡溶液組給藥后30、60、90、120 min對熱板引起的小鼠痛閾值也顯著提高（< 0.01）。

與自身給藥前相比較，純化水對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組和嗎啡溶液組，給藥后30、60、90、120 min對熱板引起的小鼠痛閾值提高顯著（< 0.01）。

爵床醇提取物高、低劑量組給藥后與相同劑量的水提取物組相比，差異顯著（< 0.01，< 0.05），顯示爵床醇提取物作用比水提取物強(qiáng)。結(jié)果見表4。

表4 爵床提取物對小鼠熱板法痛閾值的影響（, n = 12）

注：與純化水組比較，*< 0.05，**< 0.01；與自身藥前痛閾比較，##< 0.01；與水提取物比較，&< 0.05，&&< 0.01

3.5 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

與純化水對照組相比較，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組和阿司匹林組對醋酸致痛引起的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均明顯減少（< 0.01）。爵床醇提取物高、低劑量組給藥后與相同劑量的水提取物組相比較，差異顯著（< 0.01），顯示爵床醇提取物作用比水提取物強(qiáng)。結(jié)果見表5。

表5 爵床提取物對小鼠扭體次數(shù)的抑制作用（, n = 12）

注：與純化水組比較，**< 0.01；與水提取物組比較，&&< 0.01

3.6 對甲醛法所致小鼠疼痛的影響

與純化水對照組相比較，爵床醇提取物和水提取物高、低劑量組和嗎啡溶液組給藥后均顯著縮短皮下注射甲醛后0~5 min和15~30 min小鼠舔足時(shí)間(< 0.01)。爵床醇提取物高、低劑量組給藥后與相同劑量的水提取物組相比，差異顯著（< 0.01），顯示爵床醇提取物作用比水提取物強(qiáng)。結(jié)果見表6。

表6 爵床提取物對甲醛致小鼠疼痛的影響（, n = 12）

注：與純化水組比較，**< 0.01，與水提取物組比較，&&< 0.01

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)致炎劑二甲苯引起小鼠耳廓腫脹及雞蛋清引起大鼠足跖腫脹都是急性炎癥反應(yīng)，采用大鼠埋棉球引起肉芽腫是以增生為主的慢性炎癥反應(yīng)[20]。本實(shí)驗(yàn)爵床醇提取物和水提取物灌胃給藥后，對化學(xué)致炎劑二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹和雞蛋清引起的大鼠足跖腫脹均具明顯減輕，對棉球引起的大鼠肉芽腫增生具顯著抑制，表明爵床灌胃給藥對急慢性炎癥具有顯著抑制作用。

在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，采用了熱板法、醋酸扭體法和甲醛法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠熱板實(shí)驗(yàn)是通過一定的溫度（55 ℃）刺激小鼠足部以產(chǎn)生縮足、舔足等疼痛反應(yīng)。常以熱刺激開始至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時(shí)間（痛閾值）為測痛指標(biāo)[20]，并以此評價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)爵床醇提取物和水提取物灌胃給藥后對熱板刺激引起的小鼠痛閾值具明顯提高，表明爵床灌胃給藥對溫度等物理因素導(dǎo)致的疼痛有鎮(zhèn)痛作用。熱板反應(yīng)有高位中樞參與[23]，這說明爵床有一定中樞性鎮(zhèn)痛作。

小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)是通過醋酸刺激小鼠腹膜壁層和臟層引起炎性疼痛，表現(xiàn)為腹部內(nèi)凹、伸展后肢等扭體反應(yīng)，其是篩選弱鎮(zhèn)痛藥的一種敏感、簡便、重復(fù)性好的方法[23]。本實(shí)驗(yàn)中，爵床醇提取物和水提取物灌胃給藥后對化學(xué)刺激物醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)具明顯減少，提示爵床灌胃給藥對炎癥性疼痛有一定的鎮(zhèn)痛作用。

小鼠甲醛實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地模擬臨床慢性嚴(yán)重疼痛。小鼠足爪皮下注射甲醛出現(xiàn)典型的兩階段疼痛反應(yīng)，一是注射甲醛后5 min內(nèi)，二是注射甲醛后15~30 min。這兩個(gè)階段引起疼痛的機(jī)制不同，注射甲醛后5 min內(nèi)疼痛反應(yīng)主要是直接刺激C纖維所致，注射甲醛后15~30 min疼痛反應(yīng)有炎癥機(jī)制參與。嗎啡等中樞鎮(zhèn)痛藥能抑制兩階段疼痛反應(yīng)，阿司匹林等外周鎮(zhèn)痛藥只能抑制第二階段的疼痛反應(yīng)[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中，爵床醇提取物和水提取物灌胃給藥后對兩階段疼痛反應(yīng)均有顯著抑制作用。結(jié)果提示爵床灌胃給藥既可通過中樞，亦可同時(shí)通過外周炎性疼痛過程中的某個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在抗炎、鎮(zhèn)痛作用方面，作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)，而且爵床醇提取物作用比水提取物強(qiáng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用了3種炎癥動物模型和3種疼痛動物模型來研究爵床提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，爵床提取物灌胃給藥對急、慢性炎癥均具有良好的抑制作用；在鎮(zhèn)痛方面，無論是物理性疼痛，還是炎癥性疼痛，無論是急性疼痛，還是慢性疼痛都具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，而且兼有良好的中樞和外周鎮(zhèn)痛活性；在抗炎鎮(zhèn)痛方面醇提物作用比水提物強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為其臨床應(yīng)用和綜合開發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其發(fā)揮主要抗炎鎮(zhèn)痛作用的是哪種活性成分，對哪些致痛和致炎介質(zhì)有影響，有什么樣影響，這些有待于后續(xù)更深入的研究。

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EXPERIMENTAL STUDIES ON THE ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECT OFEXTRACT

*LIANG Sheng-lin1, ZHONG Wei-hua2, LI Qing-yao1, CHU Hong-biao1, ZHOU Xi-gen1

(1.Health Science Center, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2.Affiliated Hospital, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China)

: To investigate the anti-inflammatory andanalgesic effects ofextract.: The anti-inflammatory animal models were used in researching the effect ofextract on acute and chronic inflammation.The acute models were xylene-induced ear edema and egg white-induced pawedema, while the chronic one was granuloma induced bycotton pellet implantation.Meanwhile, the analgesic effect of the extract was observed by hot plate acetic, acid writhing test and the formalin induced-pain experiment.: Compared with the purified water control group, high and low doses ofalcohol and water extract could significantly inhibit ear edema in mice (< 0.01,< 0.05) and the paw edema in rat (< 0.01).Also, the alcohol and water extract decreased the granuloma of rats (< 0.01).Moreover, the pain thresholdwith hot plate method was significantly increased (< 0.01,< 0.05) compared with the purified water control group and the data before the drugs administration of high and low doses ofalcohol and water extract.And the writhing number was reduced (< 0.01) when contrasted to the purified water control group after extract administration.The alcohol and water extract also significantly inhibited foot pain response at early phase (0 - 5 min) and late phase (15 - 30 min) caused by formalin in mice (< 0.01).However, there were substantial variations in the alcohol extract groups and the same dose of water extract in high and low concentrations (< 0.01,< 0.05).:extract possesses the anti-inflammatory andanalgesic effect, alcohol extract has better effect than water extract.

; alcohol and water extract; intragastric administration; anti-inflammatory;analgesic

1674-8085(2020)01-0086-07

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.01.016

2019-09-19；

2019-10-21

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子題項(xiàng)目(2012BAC11B02-6)；吉安市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(吉市科計(jì)字[2014]4號)；

全國中藥資源普查項(xiàng)目(財(cái)社[2018]43號)

*梁生林(1962-)，男，江西吉安縣人，教授，主要從事中草藥藥理及毒理研究(E-mail: slliang1962@163.com);

鐘衛(wèi)華(1976-)，女，江西吉安人，副主任醫(yī)師，主要從事B超臨床工作(E-mail: 269568714@qq.com);

李慶耀(1965-)，男，江西吉安人，講師，主要從事中草藥藥理研究(E-mail: 506877424@qq.com);

褚洪標(biāo)(1969-)，男，河南商丘人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學(xué)研究(E-mail: hongbiaochu@163.com);

周細(xì)根(1972-)，男，江西吉水人，副教授，主要從事中草藥藥理及毒理研究(E-mail: xgzhou1972@163.com).