采用體內(nèi)實驗探討IL-17A促進卵巢癌腹腔種植瘤順鉑耐藥的機制

陳燕，牛秀瓏，郁春艷，李巖，鄧為民△

白細胞介素-17（IL-17）家族由6 個細胞因子（IL-17A～F）和5個受體（IL-17RA～RE）組成，其中IL-17A（通常也稱為IL-17）是IL-17 家族中研究最廣泛，同時也是最具代表性的細胞因子［1］。輔助性T細胞（Th17）是IL-17A的主要來源，除了Th17細胞，自然殺傷T細胞、γδT細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞也可以分泌IL-17A［2-3］。卵巢癌（OVCA）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤早期缺乏特異性診斷，轉(zhuǎn)移快、病因復(fù)雜，多數(shù)患者就診時已進入中晚期，病死率很高。研究表明，在卵巢癌的富脂微環(huán)境中聚集著大量的IL-17A，后者可通過加速腫瘤遷移、侵襲和血管生成在OVCA進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-5］。

目前，手術(shù)輔助順鉑（DDP）聯(lián)合紫杉醇的化療方案是大多數(shù)原發(fā)性O(shè)VCA 患者的有效治療方法，但化療耐藥的產(chǎn)生使卵巢癌的預(yù)后不佳。患者5年的生存率僅為30%左右。因而，OVCA 成功治療的主要挑戰(zhàn)之一是克服多藥耐藥（MDR）［6-7］。乳腺癌耐藥蛋白（ABCG2）是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族的一員，它可將進入細胞內(nèi)的化療藥物泵出，介導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生MDR，進而影響腫瘤患者的預(yù)后。ABCG2的過表達與DDP耐藥的發(fā)生密切相關(guān)［8］。前期的體外研究結(jié)果表明，IL-17A可通過神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1（Gli1）介導(dǎo)的Hh信號通路增加耐藥相關(guān)基因ABCG2 和 MDR1 的表達水平，從 而 促 進 OVCA 的DDP 耐藥［9］。在前期的體外研究的基礎(chǔ)上，本文通過建立卵巢癌腹腔種植瘤小鼠模型，探討IL-17A對卵巢癌腹腔種植瘤DDP 耐藥的影響及其影響機制是否與體外研究結(jié)果一致。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鼠卵巢癌細胞系ID8 細胞由堪薩斯大學(xué)醫(yī)療生殖中心惠贈；DMEM培養(yǎng)基購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司。24只SPF 級6～8 周雌性C57BL/6 遺傳背景的野生型（WT）小鼠由天津醫(yī)科大學(xué)動物中心贈送，24只SPF級C57BL/6遺傳背景的IL-17A-/-小鼠購自日本東京理科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所動物疾病模型中心。IL-17A、ABCG2、Gli1、MDR1 抗體購自英國Abcam公司；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國Affinity 公司；彩色預(yù)染蛋白Marker（11～245 ku）購自美國NEB公司。順鉑（DDP）購自中國山東齊魯制藥公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ID8細胞用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每1～2 d更換培養(yǎng)液并消化傳代，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，CO2濃度5%，濕度95%。待ID8 細胞生長至對數(shù)生長期，消化處理后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Western blot 實驗 Western blot 實驗檢測小鼠腹腔腫瘤組織中耐藥相關(guān)分子ABCG2、MDR1 和Hh 信號通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1 的蛋白表達情況。用裂解液充分裂解小鼠腫瘤組織，提取總蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性抗原后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃低速震蕩孵育過夜，次日，加入二抗，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光成像儀掃描電泳條帶，GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參條帶比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.3 免疫組化染色 免疫組化染色技術(shù)檢測小鼠腹腔腫瘤組織中 IL-17A、ABCG2、MDR1 和Gli1 的表達情況。所有標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化后，將切片置于0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液中95 ℃水浴20 min 進行抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶后，進行血清封閉，4 ℃一抗孵育過夜，次日，進行二抗孵育、加顯色劑DAB、復(fù)染、脫水、封片。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 小鼠腹腔種植瘤模型構(gòu)建 將ID8 細胞（5×106個，200 μL）分別注射于6～8周雌性C57BL/6遺傳背景的WT小鼠和IL-17A-/-小鼠腹腔內(nèi)。在ID8 細胞注射后的第4 天，采用隨機數(shù)字表法將兩種荷瘤小鼠分為WT 對照組、IL-17A-/-對照組、WT 治療組、IL-17A-/-治療組，每組3 只。治療組給予DDP（溶劑：生理鹽水），腹腔內(nèi)給藥；對照組小鼠以同樣方式注射同等劑量生理鹽水 1 次。DDP 注射劑量為 4 g/kg［10］，每周給藥1次。每日測量小鼠體質(zhì)量，觀察其生長情況、一般狀態(tài)。連續(xù)給藥4周和6周后，每組分別頸椎脫臼法處死小鼠3只。計數(shù)腹腔及各臟器腫瘤結(jié)節(jié)生成情況并拍照、計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）對不同處理組的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量、蛋白相對表達量進行統(tǒng)計學(xué)分析，組內(nèi)多重比較采用Tukey檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A 對小鼠卵巢癌模型DDP 耐受性的影響 各組治療4 周和6 周的瘤結(jié)節(jié)數(shù)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為42.86和35.24，P＜0.05）。WT對照組腹腔內(nèi)瘤結(jié)節(jié)數(shù)要明顯高于IL-17A-/-對照組（P＜0.01）。與WT 對照組相比，WT 治療組和IL-17A-/-治療組腹腔內(nèi)瘤結(jié)節(jié)的生成減少（P＜0.05）。IL-17A-/-治療組與WT治療組相比，腹腔內(nèi)瘤結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少（P＜0.01），DDP 治療4 周和6 周的結(jié)果一致，見圖1、2。

2.2 IL-17A 對卵巢癌腹腔種植瘤小鼠DDP 耐藥的機制 IL-17A 的表達僅在WT 治療組中檢測到，而在IL-17A-/-治療組未檢測到。WT 治療組小鼠腹腔腫瘤組織中ABCG2、MDR1、Gli1 水平明顯高于IL-17A-/-治療組，見圖3。Western blot 檢測結(jié)果顯示，各組中ABCG2、MDR1、Gli1 水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為 40.69、57.04 和 60.42，P＜0.05）；WT 對照組 ABCG2、MDR1、Gli1 的表達水平均高于 IL-17A-/-對 照 組（P＜0.05）。 WT 治 療 組 ABCG2、MDR1、Gli1的表達水平也高于IL-17A-/-治療組（P＜0.01）。與WT對照組相比，WT治療組3個蛋白分子表達上調(diào)（P＜0.01），而與IL-17A-/-對照組相比，WT治療組IL-17A-/-治療組3個蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移快、病因復(fù)雜、預(yù)后很差，嚴(yán)重危害女性健康。目前，對于卵巢癌治療的常見方案，是以手術(shù)為主，輔以放化療的綜合方案，但由于腫瘤細胞對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，很多患者治療達到臨床完全緩解后，會出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此化療藥物耐藥已成為晚期卵巢癌患者治療失敗而死亡的主要原因之一［10］。DDP 是一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，以DDP 為基礎(chǔ)的輔助化療方案已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療中，DDP 耐藥的產(chǎn)生極大地影響了腫瘤化療的臨床效果，其治療效果往往不盡如人意。

IL-17A是一種多效性細胞因子，可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細胞因子、趨化因子的表達和免疫細胞的數(shù)量、活性來促進腫瘤血管生成，是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分之一，在多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮不同的作用。研究顯示，Gli1介導(dǎo)的Hh信號通過靶向上皮性O(shè)VCA 中的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2 和MDR1 調(diào)控藥物敏感性，其潛在機制與Gli1、ABCG2和MDR1基因啟動子直接相關(guān)［11］。ABCG2和MDR1是ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族的一員，可以將細胞內(nèi)的DDP 泵出細胞外，介導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥，影響腫瘤患者的臨床療效。本課題組前期的研究結(jié)果表明外源性IL-17A 可通過其受體直接作用于卵巢癌細胞系A(chǔ)2780 和OVCAR3 細胞，通過Gli1 介導(dǎo)的Hh 信號通路增加耐藥相關(guān)基因ABCG2 和MDR1 的表達水平，從而促進OVCA的DDP耐藥［9］。

為了進一步探討IL-17A 誘導(dǎo)卵巢癌細胞DDP耐藥性的發(fā)生機制，本研究通過建立腹腔種植瘤動物模型，采用免疫組化染色技術(shù)和Western blot方法探討內(nèi)源性IL-17A 對卵巢癌DDP 耐藥的影響及其影響機制。結(jié)果表明，內(nèi)源性IL-17A可以顯著增加小鼠腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。這與本課題組前期的rhIL-17A對A2780和OVCAR3的增殖均無明顯作用的體外實驗結(jié)果相矛盾。這一現(xiàn)象與Tartour 等［12］的研究結(jié)果相一致，他們認(rèn)為IL-17A誘導(dǎo)的腫瘤生長增強與IL-6 在體內(nèi)表達增加以及腫瘤部位巨噬細胞募集有關(guān)。筆者認(rèn)為造成此結(jié)果的一個重要原因是血管生成。腫瘤在體內(nèi)的生長不僅依賴于自身的生長，還可能與血管生成等其他因素有關(guān)［13］。許多研究報道IL-17A可促進腫瘤微環(huán)境的血管生成。免疫組化染色和Western blot 結(jié)果表明內(nèi)源性IL-17A 可上調(diào)耐藥相關(guān)分子ABCG2 和MDR1 蛋白表達，且Gli1 的蛋白表達也隨著ABCG2 和MDR1 的表達水平的增加而增加，這與體外研究結(jié)果一致。

綜上所述，內(nèi)源性IL-17A 可通Gli1 介導(dǎo)的Hh信號通路上調(diào)ABCG2和MDR1的表達，進而增強卵巢癌DDP耐藥。靶向IL-17A-Gli1信號可能是提高OVCA對DDP耐藥的一個新策略。