混菌發(fā)酵接種比例對(duì)美樂低醇葡萄酒香氣品質(zhì)的影響

趙芳琴，王詩，趙丹丹，宋茹茹，楊學(xué)山，韓舜愈，祝霞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070)

隨著人們生活水平和保健意識(shí)的不斷提升，消費(fèi)者對(duì)酒類的需求也逐漸向低度、健康方向發(fā)展[1].酒精度為1.0%～7.0%(V/V)的低醇葡萄酒不僅含有較為豐富的酚類化合物、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，而且有效避免了高酒精度對(duì)女性、老人、青年及酒精不耐受人群身體及心理的負(fù)面影響，具有廣闊的市場(chǎng)前景[2-3].目前，國(guó)內(nèi)對(duì)低醇葡萄酒的開發(fā)還處在起步階段，曾林[4]、張傳軍[5]、李記明[6]、高玉榮等[7]分別采用減少可發(fā)酵糖、膜過濾技術(shù)、滲透蒸發(fā)技術(shù)、冷凍分離等理化技術(shù)進(jìn)行脫醇處理生產(chǎn)低醇葡萄酒，這些傳統(tǒng)手段雖然能達(dá)到降低酒精度的目的，但工藝控制難度大，成本高，同時(shí)還顯著的影響了酒體香氣及感官品質(zhì)，導(dǎo)致消費(fèi)者的認(rèn)可度較低.近年來，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)一些非釀酒酵母(non-Saccharomyces)菌株不僅具有降低葡萄酒酒精度的潛力，而且對(duì)葡萄酒成分、風(fēng)味和香氣均有積極影響[8-10].然而，非釀酒酵母菌大多發(fā)酵力弱，無法單獨(dú)完成發(fā)酵，需要同時(shí)接種或順序接種釀酒酵母(Saccharomycescerevisia,S.cerevisia)進(jìn)行混菌發(fā)酵，確保完成酒精發(fā)酵的順利進(jìn)行[11].Varela[12]、Contreras等[13]均發(fā)現(xiàn)順序接種美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima,M.pulcherrima)和S.cerevisia混菌發(fā)酵能降低干紅葡萄酒的酒精度，且發(fā)酵酒樣具有較高的酯類濃度和高級(jí)醇含量.Patricia等[14]順序接種戴爾有孢圓酵母(Torulasporadebrueckii,Tdebrueckii)和S.cerevisia進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵，可降低酒樣中揮發(fā)酸和增加香氣復(fù)雜性.Powles等[15]研究發(fā)現(xiàn)，將M.pulcherrima與S.cerevisia共酵能顯著提高萜烯類和內(nèi)酯類等芳香族化合物含量.王媛等[16]利用混菌發(fā)酵生產(chǎn)的低醇葡萄酒中酯類、高級(jí)醇和萜烯類物質(zhì)含量均高于對(duì)照.在混菌發(fā)酵過程中，接種比例是影響葡萄酒的感官品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[17].有學(xué)者發(fā)現(xiàn)接種比例為1∶1時(shí)的東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)與S.cerevisia混菌發(fā)酵的‘坎貝爾’葡萄酒感官品質(zhì)最佳[18].王倩倩等[19]發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵接種比例為1:1時(shí)，不僅提升了‘愛格麗’干白葡萄酒的品種香氣和發(fā)酵香氣含量，還顯著提高了中鏈脂肪酸乙酯的含量，但有關(guān)不同接種比例對(duì)低醇葡萄酒香氣品質(zhì)特征的影響尚未見報(bào)道.

本試驗(yàn)利用M.pulcherrima346與S.cerevisiaES488混菌發(fā)酵釀造美樂低醇葡萄酒，分析不同接種比例對(duì)美樂低醇葡萄酒的香氣成分與香氣特征的影響，從而篩選出混菌發(fā)酵增香性能最優(yōu)的接種方式，以期為釀造高品質(zhì)的低醇葡萄酒提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美樂釀酒葡萄：2018年采自甘肅莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司黃羊鎮(zhèn)葡萄種植基地，糖度為24.4 Brix°，總酸為6.0 g/L(以酒石酸計(jì))，pH為3.57.

釀酒酵母：SaccharomycescerevisiaES488，購自意大利Enartis公司；

非釀酒酵母：Metschnikowiapulcherrima346，購自法國(guó)Lallemand公司；

果膠酶：EX-V，購自法國(guó)Lallemand公司.

1.2 儀器與試劑

TRACE 1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；DB-WAX氣相色譜柱(60m×0.25mm，0.25μm，美國(guó)Agilent Technologies公司)；固相微萃取裝置(solid phase microextraction，SPME)、萃取頭(50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅(divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS))，美國(guó)Surpelco公司).

國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑：酒石酸、氫氧化鈉、偏重亞硫酸鈉、氯化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水葡萄糖、鄰苯二甲酸氫鉀等；2-辛醇(色譜純)購自美國(guó)Sigma公司；按GB/T603-2002《化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》方法配制次甲基藍(lán)、酚酞等指示劑.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化 非釀酒酵母菌株活化：稱取相應(yīng)質(zhì)量的M.pulcherrima346活性干粉于試管中，加入10倍體積的蒸餾水，放置于28 ℃水浴鍋中恒溫復(fù)水活化15 min.再向試管中加入等體積的葡萄汁，于20 ℃下恒溫水浴活化10 min.

釀酒酵母菌株活化：稱取相應(yīng)質(zhì)量的S.cerevisiaES488活性干粉于試管中，加入10倍體積的蒸餾水，放置于28 ℃水浴鍋中恒溫復(fù)水活化15 min.再向試管中加入等體積的葡萄汁，于20 ℃下恒溫水浴活化10 min.

1.3.2 美樂低醇葡萄酒的釀造工藝 參照王媛等[16]的方法，美樂葡萄分選→除梗破碎(添加40 mg/L SO2、20 mg/L 果膠酶)→浸漬(4 ℃，48 h)→皮渣分離→美樂葡萄清汁→接種非釀酒酵母(置于20 ℃恒溫發(fā)酵至酒精度為3.5%)→接種釀酒酵母(20 ℃恒溫發(fā)酵至酒精度為6.5%)→4 ℃恒溫靜置→錯(cuò)流過濾→取澄清液即得美樂低醇葡萄酒.

1.3.3 不同混菌接種比例 參考Varela[12]、Contreras[20]、區(qū)嘉欣[21]和原苗苗[22]等的研究結(jié)果，以M.pulcherrima346和S.cerevisiaES488活性干粉質(zhì)量比設(shè)計(jì)接種比例，分別標(biāo)記為：A組：0.5∶1(0.1 g/LM.pulcherrima346和0.2 g/LS.cerevisiaES488)、B組：1∶1(0.2 g/LM.pulcherrima346和0.2 g/LS.cerevisiaES488)、C組：1∶0.5(0.2 g/LM.pulcherrima346和0.1 g/LS.cerevisiaES488)；D組：1∶0(單獨(dú)接種0.2 g/LM.pulcherrima346)；E組：0∶1(單獨(dú)接種0.2 g/LS.cerevisiaES488).

各處理均重復(fù)3次，在發(fā)酵過程中每天定時(shí)搖瓶2次.發(fā)酵結(jié)束后，分別取酒樣200 mL，4 ℃保存，進(jìn)行相關(guān)理化指標(biāo)及香氣成分分析.

1.3.5 美樂低醇葡萄酒揮發(fā)性香氣成分測(cè)定

1.3.5.1 HS-SPME/GC-MS條件 利用HS-SPME/GC-MS對(duì)發(fā)酵酒樣中的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行定性定量分析.頂空固相微萃取及GC-MS條件參照祝霞等[24]的方法進(jìn)行.

1.3.5.2 定性與定量 采用NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對(duì)進(jìn)行定性分析，譜庫比對(duì)時(shí)要求匹配度大于700.采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，內(nèi)標(biāo)為2-辛醇.計(jì)算公式如下：

式中，X為香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度(μg/L)；A2為香氣物質(zhì)的峰面積；C1為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度(μg/L)；A1為測(cè)得內(nèi)標(biāo)物的峰面積.

1.3.6 感官評(píng)價(jià) 參照王玉華等[25]的香氣評(píng)價(jià)方法，并略作修改.由10位經(jīng)過培訓(xùn)的品酒員(6名女性和4名男性)組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)所釀造的酒樣分別從外觀(色澤、澄清度)、香氣(花香、果香、酒香、濃郁度)、滋味(酸味、甜味、協(xié)調(diào)性)、典型性共10個(gè)屬性進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，用8分結(jié)構(gòu)化數(shù)值進(jìn)行量化，0～8分表示感官強(qiáng)烈程度逐漸增強(qiáng).感官評(píng)價(jià)結(jié)果利用感官雷達(dá)圖進(jìn)行分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的基本處理均利用Microsoft Office Excel 2010軟件，并利用IBM SPSS Statistics 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.其中，采用多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，對(duì)不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 成品美樂低醇葡萄酒理化指標(biāo)分析

由表1可知，發(fā)酵終止后，不同接種比例混菌發(fā)酵所得酒樣殘?zhí)呛吭?21.00～129.00 g/L之間，各處理組的pH值在3.5左右，酒精度在6.4%～6.73%之間，均小于7.0%.A-D組的酒精度、pH值與E組均存在顯著性差異(P<0.05).本試驗(yàn)各處理組的揮發(fā)酸含量(以乙酸計(jì))在0.49～0.55 g/L之間，均小于1.2 g/L，A與D組無顯著性差異，D與E處理組存在顯著性差異.此外，D處理組的總酸含量最低，為5.16 g/L，與其他各處理組均存在顯著性差異(P<0.05).總體而言，本試驗(yàn)酒樣的各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)GB/T 15037-2006的要求.

表1 美樂低醇葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different the lower letters indicate significant differences(P<0.05).

2.2 成品美樂低醇葡萄酒揮發(fā)性香氣化合物分析

2.2.1 不同接種比例對(duì)美樂低醇葡萄酒香氣化合物種類的影響

5組不同混菌接種比例所釀的美樂低醇葡萄酒樣中共檢出95種香氣物質(zhì)，其中萜烯類5種、降異戊二烯類2種、酯類33種、高級(jí)醇類29種、酸類12種、醛類5種、酮類2種、其他類7種.A組和C組發(fā)酵的酒樣中香氣成分種類相對(duì)較少，均檢出64種(占總香氣種類的69.57%)；D組和E組發(fā)酵的酒樣中分別檢出65、66種(分別占總香氣種類的70.65%、71.74%)，B組是檢出香氣物質(zhì)種類最多的處理組，共檢出70種(占總香氣種類的76.09%).

圖1 不同接種比例發(fā)酵酒樣的香氣種類比較Figure 1 Comparison of aroma types of fermented wine samples with different inoculation ratios

由圖1可知，不同接種比例發(fā)酵酒樣產(chǎn)生的香氣物質(zhì)種類存在差異.A和B組處理中檢出的萜烯類化合物相對(duì)較多，為5種(分別占各處理組總香氣種類的7.81%和7.14%).C、D和E組處理中均檢出4種(6.25%、6.15%和6.06%).A-E組處理中均檢出2種降異戊二烯類物質(zhì).A組處理中檢出18種酯類化合物(28.13%)；E組處理中檢出27種(40.91%)，是5組處理中酯類檢出種類最多的處理組.B組共檢出高級(jí)醇類化合物22種(31.43%)；A、C和D組處理中依次檢出高級(jí)醇類化合物19種(29.69%)、18種(28.13%)、17種(26.15%)；E組處理中檢出的高級(jí)醇類化合物最少，為14種(21.21%).A-E組處理中均檢出酸類化合物9種(14.06%、12.86%、14.06%、13.85%、13.64%).A、B和D組處理中均檢出4種醛類化合物(6.25%、5.71%和6.15%)，C和E組處理檢出3種(4.69%和4.55%).A-E組處理中均檢出2種酮類化合物(依次為3.13%、2.86%、3.13%、3.08%和3.03%).A和E組處理中檢出5種其他類化合物(7.81%和7.58%)，B、C和D處理中檢出6種(8.57%、9.38%和9.23%).

2.2.2 不同接種比例對(duì)美樂低醇葡萄酒香氣化合物含量的影響

2.2.2.1 萜烯類化合物 在釀酒過程中，酵母菌株可以產(chǎn)生糖苷酶水解萜烯糖苷釋放單萜，賦予葡萄酒品種香氣特征[26].本試驗(yàn)共檢出5種萜烯類化合物(芳樟醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇和α-松油醇)，占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的0.01%～0.33%.如圖2所示，B處理組中萜烯類的含量與其他處理組均存在顯著性差異(P<0.05)，萜烯類化合物的含量最高(61.23 μg/L)，A處理組次之(30.41 μg/L)，其他各處理組的含量均在22 μg/L以下.B處理酒樣中的芳樟醇、香茅醇和香葉醇的含量顯著高于對(duì)照酒樣，尤其是香茅醇的含量為21.95 μg/L，明顯高于對(duì)照組D(3.38 μg/L)和E(8.17 μg/L).

圖2 不同接種比例對(duì)萜烯類化合物含量的影響Figure 2 Effects of different inoculation ratios on terpene compounds contents

2.2.2.2 降異戊二烯類化合物 降異戊二烯類化合物是由類胡蘿卜素降解產(chǎn)生，可進(jìn)一步氧化生成紫羅蘭酮、大馬士酮等[27].本試驗(yàn)所檢出的降異戊二烯類化合物分別是β-大馬士酮和香葉基丙酮，且在各處理組均有檢出，占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的0.01%～0.74%.如圖3所示，B處理組酒樣的降異戊二烯類化合物總量最高(54.63 μg/L)，E組該類物質(zhì)總含量最低(4.57 μg/L)，主要是B組酒樣中β-大馬士酮的含量(48.67 μg/L)顯著高于E組(0.54 μg/L).

2.2.2.3 酯類化合物 研究表明，在酒精發(fā)酵過程中，酵母菌在酯酶或醇酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下可合成多種酯類[28]，可為葡萄酒提供濃郁的花香和果香香氣.本試驗(yàn)中酯類化合物的含量較高，占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的32.96%～52.84%.混菌發(fā)酵組中酯類的含量與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05).由圖4可知，B和C組的酯類化合物含量較高，分別為2 336.19 、2 302.36 μg/L，E處理組最低，為1 736.35 μg/L.尤其是B處理組中的乙酸乙酯(748.78 μg/L)、乙酸異戊酯(124.93 μg/L)、丁二酸二異丁酯(29.66 μg/L)的含量顯著高于對(duì)照組E(分別為149.00、112.21、4.04 μg/L).

圖3 不同接種比例對(duì)降異戊二烯類化合物的影響Figure 3 Effects of different inoculation ratios on norisoprenoid compounds

圖4 不同接種比例對(duì)酯類化合物的影響Figure 4 Effects of different inoculation ratios on esters compounds

2.2.2.4 高級(jí)醇類化合物 高級(jí)醇是構(gòu)成酒精飲料特征氣味的基本物質(zhì)，所表現(xiàn)的香氣比較復(fù)雜，如醇香、花香、脂肪香，辛辣味等[29].本試驗(yàn)中該類化合物的含量最高(占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的38.36%～61.05%)，如圖5所示，B處理組高級(jí)醇類化合物含量最高，為3 760.57 μg/L，A處理組次之，為3 559.86 μg/L.D處理組最低，為1 292.33 μg/L.總體而言，混菌發(fā)酵處理組中的異丁醇、異戊醇、正己醇、苯甲醇、苯乙醇的含量均較高，且在B處理組中的含量均顯著高于對(duì)照組.

圖5 不同接種比例對(duì)高級(jí)醇類化合物的影響Figure 5 Effects of different inoculation ratios on higher alcohol compounds

2.2.2.5 酸類化合物 葡萄酒中低濃度的酸類化合物表現(xiàn)為奶酪和奶油氣味，在高濃度時(shí)可能會(huì)表現(xiàn)為醋酸味、腐敗和刺激味，它們對(duì)葡萄酒香氣的平衡起著重要作用[30].本試驗(yàn)中酸類化合物占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的3.84%～8.95%.如圖6所示，E處理組中酸類含量顯著高于其他處理組，為380.82 μg/L，而D處理組含量最低，為166.77 μg/L，其他處理的酸含量處于中間水平：A(229.72 μg/L)、B(253.11 μg/L)和C(223.75 μg/L).己酸和辛酸等物質(zhì)是酵母發(fā)酵過程中合成細(xì)胞膜所需長(zhǎng)鏈脂肪酸的剩余片段，其量的積累對(duì)酵母的生長(zhǎng)有毒性作用[31].且辛酸和己酸會(huì)給酒帶來酸敗味和脂肪味，對(duì)酒體有不利的影響.本試驗(yàn)中混菌發(fā)酵酒樣中己酸、辛酸、2-甲基丁酸的含量均顯著低于對(duì)照組E，在一定程度上降低了負(fù)面影響.

圖6 不同接種比例對(duì)酸類化合物的影響Figure 6 Effects of different inoculation ratios on acid compounds

2.2.2.6 醛類化合物 醛類化合物是葡萄酒中常見的香氣化合物，產(chǎn)生于酒精發(fā)酵過程中，可由丙酮酸鹽脫羧生成，多呈現(xiàn)植物性清香[32].本試驗(yàn)檢出的醛類化合物含量并不高，約占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的0.26%～2.29%，如圖7所示，D處理組醛類化合物的含量最高，為77.09 μg/L；E處理組次之，為69.07 μg/L.在醛類化合物中，壬醛表現(xiàn)為花果香，在C處理組中含量為11.97 μg/L，而在對(duì)照E組中則為9.91 μg/L；而呈現(xiàn)扁桃仁味的苯甲醛，在對(duì)照D組中含量為54.77 μg/L，在C處理組中含量卻較低，為47.64 μg/L.

圖7 不同接種比例對(duì)醛類化合物的影響Figure 7 Effects of different inoculation ratios on aldehydes compounds

2.2.2.7 酮類化合物 酮類化合物對(duì)葡萄酒的香氣品質(zhì)有一定的貢獻(xiàn).本試驗(yàn)共檢出酮類化合物2種，分別是2,3-戊二酮和甲基庚烯酮，前者主要表現(xiàn)為乳脂奶香，而后者則表現(xiàn)為水果香氣和新鮮清香香氣.本試驗(yàn)所檢出的酮類化合物占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的0.04%～0.13%.如圖8所示，B處理組中酮類化合物的含量最高，達(dá)8.71 μg/L.A處理組次之，E處理組最低.且除B組外，其他各處理組中酮類的含量均低于5 μg/L.其中B處理組中2,3-戊二酮(6.93 μg/L)的含量顯著高于對(duì)照組E(0.45 μg/L).

2.2.2.8 其他類化合物 本試驗(yàn)共檢出7種其他類香氣化合物，占相應(yīng)處理香氣物質(zhì)總量的0.52%～1.37%.其中，僅在A和B處理組中檢出萜品油烯，該化合物具有松木樹脂的氣味，可為葡萄酒提供特有的清香口感.如圖9所示，B組中其他類香氣化合物的含量顯著高于其他處理組，為90.71 μg/L，與對(duì)照組D和E相比，其含量分別增加了114.70%和95.66%，A處理組含量最低，為30.26 μg/L.

圖8 不同接種比例對(duì)酮類化合物的影響Figure 8 Effects of different inoculation ratios on ketones compounds

圖9 不同接種比例對(duì)其他類化合物的影響Figure 9 Effects of different inoculation ratios on other compounds

2.3 各處理酒樣揮發(fā)性香氣的主成分分析

為進(jìn)一步探究不同接種比例發(fā)酵的酒樣在香氣成分上的整體差異，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)多元統(tǒng)計(jì)法研究揮發(fā)性香氣化合物的變化.根據(jù)主體香氣成分的主成分因子載荷圖，取特征值大于1的為主要成分，共提取了4個(gè)公因子，得到PC1、PC2和PC3的方差貢獻(xiàn)率分別為54.05%、25.56%和10.36%，前3個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為89.97%，基本能反映原數(shù)據(jù)89.97%的變異信息.各香氣物質(zhì)在PC1、PC2和PC3上的因子載荷如圖10(a)(b)，香氣化合物酒樣分布如圖11.

由圖10(a)(b)可以看出，D7(1-壬醇)、D20(Z-6-壬烯-1-醇)、A5(α-松油醇)、B1(β-大馬士酮)、C17(丁二酸二異丁酯)、C25(己二酸二異丁酯)、D2(異戊醇)、D11(葉醇)、D25(異胡薄荷醇)、D14(順-2-己烯-1-醇)、E8(異丁酸)等具有果香、花香、杏仁味、薄荷味、脂肪味的香氣物質(zhì)與PC1高度正相關(guān)；與PC1高度負(fù)相關(guān)的是具有果香味的酯類、醇類(C7(壬酸乙酯)、C8(正己酸乙酯)、C19(反式-2-己烯酸乙酯)、C21(3-羥基丁酸乙酯)、D3(1-戊醇)、D18(3-甲基-1-戊醇)、醛類及其他類物質(zhì)(F1(壬醛)、F2(癸醛)、F3(苯甲醛)、H1(苯乙烯)).PC2正半軸上得分較高的主要為酯類和醇類(C6(癸酸乙酯)、C9(異戊酸乙酯)、C13(己酸異戊酯)、C31(棕櫚酸甲酯)、D6(1-辛醇)、C32(辛酸甲酯)、D8(2-壬醇)、D10(月桂醇))等香氣化合物，這些化合物能夠賦予葡萄酒濃郁的花香、果香味；而E3(丁酸)、E9(2-甲基丁酸)、E11(月桂酸)等酸類物質(zhì)使葡萄酒有奶酪味；與PC2高度負(fù)相關(guān)的是C5(辛酸乙酯)、D5(庚醇).PC3正半軸上主要體現(xiàn)了B2(香葉基丙酮)、C18(水楊酸甲酯)、C26(肉豆蔻酸異丙酯)、H3(月桂烯)、H6(2,4-二叔丁基苯酚)等香氣物質(zhì).

a:PC1-PC2,b:PC1-PC3.圖10 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Figure 10 Factor loadings plot of PCA for volatile aroma compounds

圖11反映出混菌發(fā)酵的A組位于PC1的正半軸及PC2的負(fù)半軸，B組和C組位于PC1的負(fù)半軸及PC2的負(fù)半軸；D組分別位于PC2負(fù)半軸及PC3負(fù)半軸，E組分別位于PC2正半軸及PC3負(fù)半軸，且相距較遠(yuǎn)，結(jié)合因子載荷圖10可得知混菌發(fā)酵與對(duì)照單獨(dú)發(fā)酵的香氣化合物有明顯差異.混菌發(fā)酵的A、B、C組距離較近，可聚為1類，主體香氣物質(zhì)為α-松油醇、芳樟醇、香茅醇、異丁醇、月桂醇、1-癸醇、乙酸乙酯，這些物質(zhì)可使葡萄酒具有更濃郁的花香、果香味，增加葡萄酒香氣復(fù)雜性.D組可單獨(dú)聚為1類，與醇類物質(zhì)(2-丁基-1-辛醇、1-壬烯-3-醇、順-3-壬烯-1-醇)相關(guān)；單獨(dú)接種的S.cerevisia 的E組可聚為1類，在PC2上得分最高.

圖11 香氣化合物主成分分析的酒樣分布圖Figure 11 Score plot of wine samples for PCA of the volatile aroma compounds

2.4 感官分析

圖12為不同接種比例混菌發(fā)酵的美樂低醇桃紅葡萄酒的感官分析雷達(dá)圖.從外觀方面分析，5組酒樣的色澤和澄清度無較大差異.酸味評(píng)分中E組最高，這與E組酒樣的酸類物質(zhì)含量高于其他處理組的結(jié)果相符.A、C組甜味較高，D組次之，B、E組甜味評(píng)分最低.從香氣角度分析，混菌發(fā)酵A、B、C組酒樣的花香、果香、香氣濃郁度、酒香的評(píng)分明顯高于對(duì)照組D、E，這是由于混菌發(fā)酵提高了酒樣中香氣化合物的含量，提升了酒樣中花香、果香及濃郁度.綜合分析，B組的香氣特征明顯，花果香突出，酒體澄清透明，酸甜適口.

圖12 不同處理組葡萄酒樣感官分析雷達(dá)圖Figure 12 Sensory analysis radar map of wine samples in different treatment groups

3 討論

混菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量揮發(fā)性香氣物質(zhì)對(duì)葡萄酒的感官特性起到促進(jìn)作用，且非釀酒酵母和釀酒酵母的比例不同，其含量和種類進(jìn)一步改變[17].本試驗(yàn)結(jié)果表明，單一接種非釀酒酵母和釀酒酵母酒樣中的揮發(fā)性香氣化合物總含量相對(duì)較低，而混菌發(fā)酵酒樣中總含量最高可達(dá)6 597.73 μg/L，并且高級(jí)醇類、酯類、萜烯類等香氣化合物的含量均有增加，有效提升了低醇葡萄酒的香氣復(fù)雜性和典型性，這與許維娜[33]、王媛等[16]混菌發(fā)酵葡萄酒的試驗(yàn)結(jié)果一致.

本試驗(yàn)各發(fā)酵酒樣中共檢測(cè)到5種萜烯類化合物(芳樟醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇和α-松油醇)，且混菌發(fā)酵處理組中的萜烯類物質(zhì)的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05).這與Sadoudi等[34]學(xué)者采用Candidazemplinina與釀酒酵母共發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中萜烯醇濃度高于單一接種釀酒酵母對(duì)照的結(jié)果相似.研究表明，萜烯類物質(zhì)的含量差異與菌株的糖苷酶活性有關(guān)[35].B處理組中萜烯類物質(zhì)總含量最高，可能是非釀酒酵母混菌發(fā)酵接種較高比例時(shí)培養(yǎng)物中的葡萄糖苷酶活性較高，從而使葡萄中非揮發(fā)性的糖苷類前體物質(zhì)(萜烯-葡萄糖苷)被大量水解，促進(jìn)了萜烯醇的產(chǎn)生[36]，賦予酒樣較為濃郁的花香.混菌發(fā)酵提高了大多數(shù)酯類物質(zhì)的含量，特別是具有梨香和菠蘿香味的辛酸乙酯含量比對(duì)照E組增加了4.18%～24.54%，是各處理組酒樣中是含量較高的酯類化合物，這與Varela等[37]學(xué)者利用美極梅奇酵母和釀酒酵母發(fā)酵的美樂葡萄酒中酯類濃度明顯增加的結(jié)果一致.究其原因，可能是混菌發(fā)酵接種菌株之間的一些相互作用促進(jìn)了乙酰輔酶A的氧化脫羧反應(yīng)，產(chǎn)酯量增加，提升了酒體的果香味.低濃度的高級(jí)醇會(huì)增加對(duì)葡萄品種香氣的感知，尤其是苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的苯乙醇，可呈現(xiàn)獨(dú)特的玫瑰香、紫羅蘭香味，對(duì)酒體香氣品質(zhì)具有積極影響.相比純種發(fā)酵，試驗(yàn)混菌發(fā)酵酒樣中苯乙醇含量顯著增加，最高達(dá)到1 656.81 μg/L，比單一發(fā)酵釀酒酵母的對(duì)照增加了107.46%，賦予了酒體優(yōu)雅的風(fēng)味特征，這與趙賓賓[38]、Comitini等[39]研究報(bào)道的結(jié)果一致.同時(shí)，苯乙醇含量的提高也與非釀酒酵母菌酵母的代謝活性有關(guān)，這在其他非釀酒酵母菌的混合發(fā)酵中也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)[40].其他揮發(fā)性物質(zhì)如醛類、酮類、酚類等物質(zhì)，雖然總體含量不高，但它們與酯類、醇類、酸類等物質(zhì)協(xié)同配合，共同賦予低醇葡萄酒果香典型、酒體協(xié)調(diào)的風(fēng)格.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用不同混菌發(fā)酵接種比例釀造的美樂低醇葡萄酒的香氣種類和含量均存在差異.發(fā)酵酒樣中共檢出95種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中B處理組檢出的香氣物質(zhì)種類最多(70種)，比對(duì)照組D、E分別增加5種和4種；B組的香氣化合物總含量也最高(6 597.73 μg/L)，與對(duì)照組相比，萜烯類、降異戊二烯類、酯類、醇類、酮類等化合物含量明顯增加.感官評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)一步表明，B組酒樣的花果香濃郁，酸甜適口，香氣特征明顯.綜合分析，非釀酒酵母M.pulcherrima346與S.cerevisiaES488的接種比例為1:1時(shí)，可有效提升美樂低醇葡萄酒的香氣品質(zhì).