抗新型冠狀病毒靶點及藥物研究進展

韓露，王同興，肖智勇，周文霞，張永祥

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

2002年末以來，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）等冠狀病毒的傳播，不僅導致了嚴重的人類疾病，威脅民眾的生命安全，還引發(fā)嚴峻的公共衛(wèi)生危機，造成了巨大經(jīng)濟損失［1-3］。因SARS-CoV-2 感染引起的COVID-19已在全球范圍內大流行，成為自1918 年流感大流行暴發(fā)以來最大的公共衛(wèi)生、社會和經(jīng)濟危機。然而，迄今尚無針對冠狀病毒的特效防治藥物。此次疫情發(fā)生后，我國迅速啟動了包括藥物篩選、研發(fā)等在內的科技攻關計劃，首先對已上市或處于臨床研究階段的對COVID-19可能有效的藥物進行了篩選和研究，發(fā)現(xiàn)一些具有抗SARS-CoV-2活性的藥物，如氯喹（chloroquine）、羥氯喹（hydroxychloroquine）、法匹拉韋（favipiravir）和瑞德西韋（remdesivir）等［4］。隨著疫情進展，國外也開展了抗SARSCoV-2 藥物的研發(fā)，但這些藥物療效有待進一步研究確定。隨后進一步的研究發(fā)現(xiàn)，氯喹不能有效阻止SARS-CoV-2 入侵肺細胞［5］，提示氯喹可能對治療COVID-19 療效欠佳。深入研究并闡明SARSCoV-2的生物學特性、感染和致病等機制，尋找有效靶標，研發(fā)療效及安全性好的抗SARS-CoV-2 藥物是當前的迫切需求。本文介紹SARS-CoV-2 的組成和生存周期，綜述其潛在的靶點和藥物研發(fā)現(xiàn)狀，為快速有效地研發(fā)COVID-19 防治藥物提供參考。

1 SARS-CoV-2結構與生存周期

導致COVID-19 的病原體SARS-CoV-2 是一組高度多樣、具包膜的正義單鏈RNA 病毒，與SARS-CoV 和MERS-CoV 同屬于β 冠狀病毒［1］。SARS-CoV-2 的基因組成和功能與已知冠狀病毒具有高度相似性［6］。SARS-CoV-2 基因組由多達29 個開放閱讀框和一些附屬基因組成，長度約30 kb［1］。SARS-CoV-2 確切的功能蛋白數(shù)目雖尚待確定，但至少有16 種非結構蛋白、4 種結構蛋白和6～7種輔助蛋白得到了確認。

1.1 結構

冠狀病毒屬病毒顆粒由外層的包膜和內層的核衣殼構成，包膜與細胞膜一樣同為磷脂雙分子層結構，其中包含由病毒基因組編碼的結構蛋白包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S蛋白）、包膜蛋白（envelope protein，E 蛋白）和膜蛋白（membrane protein，M 蛋白），核衣殼則由核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）和病毒RNA組裝而成（圖1A）。

S 蛋白在病毒-細胞受體相互作用中起著關鍵作用，對抗病毒藥物或疫苗的開發(fā)具有重要意義。S蛋白由S1亞基和S2亞基組成，其中S1具有與受體結合的功能，而S2 則介導隨后與宿主細胞膜融合［3］。S1 亞基的受體結合域（receptor-binding domain，RBD）與宿主受體結合，觸發(fā)S2 亞基的構象變化，使病毒和宿主細胞膜接近并產生融合［7］（圖1B）。E蛋白是一種小型膜結合蛋白，參與病毒裝配和出芽等。M 蛋白是冠狀病毒最豐富的結構蛋白，主要功能是維持病毒包膜的形狀，并可將其他結構蛋白募集到“內質網(wǎng)-高爾基中間室（endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment，ERGIC）”以介導病毒組裝和出芽。N蛋白的主要作用是與病毒基因組RNA結合并形成螺旋狀核糖核蛋白，參與基因組保護、病毒RNA 復制、病毒體組裝和免疫逃逸。

非結構蛋白主要由冠狀病毒的2個功能開放閱讀框（open reading frame，ORF）1a 和ORF1b 編碼。ORF1a/b 翻譯出多聚蛋白1a（polyprotein 1a，pp1a）和pp1ab，它們被木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papainlike protease，PLpro）和3-胰凝乳樣蛋白酶（3Clike protease，3CLpro）分割產生多個非結構蛋白，其中包括參與病毒轉錄和復制的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和解旋酶等［3，8］（圖1）。

SARS-CoV-2 作為冠狀病毒屬成員，其基因組和結構組成與其他冠狀病毒基本相同，而基因組中的關鍵位點差異導致SARS-CoV-2 的不同致病特點及感染后果［9］。其結構蛋白中的S蛋白在病毒吸附和穿入細胞中發(fā)揮關鍵作用，E蛋白、M蛋白和N蛋白則對于病毒的裝配起關鍵作用；非結構蛋白包括病毒的酶以及由非結構蛋白組成的復制復合體，在病毒完成整個生命周期中起關鍵作用。這些蛋白、病毒結構中的脂質膜以及結構和復制中的核酸都可成為抗病毒的重要靶點。由于病毒生存周期高度依賴宿主，所有參與病毒生存周期的宿主蛋白也都可成為重要的抗病毒宿主靶點。

1.2 復制周期

SARS-CoV-2 復制周期與其他冠狀病毒相似，包括吸附、穿入、脫殼、核酸和蛋白質合成、裝配和釋放5 個步驟。吸附：首先SARS-CoV-2 通過S 蛋白與宿主表面受體蛋白結合，實現(xiàn)吸附作用（圖2①）。冠狀病毒可吸附的宿主蛋白包括血管緊張素轉換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、氨肽酶N（aminopeptidase N）和CD147等，而目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 可以利用ACE2 或CD147 實現(xiàn)吸附［10-13］。穿入：吸附之后，SARS-COV-2 可通過2種途徑穿入細胞（圖2①），一種是胞內體途徑，另一種是細胞表面非胞內體途徑［3］。其中胞內體途徑需要依靠低pH 值環(huán)境以及pH 依賴性的半胱氨酸蛋白酶，從而促進膜融合反應［14-15］。冠狀病毒穿入的非胞內體途徑依賴其他宿主蛋白酶，如跨膜蛋白酶絲氨酸2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）和跨膜蛋白酶絲氨酸11D（transmembrane protease serine 11D，TMPRSS11D）。蛋白酶可將S 蛋白切割成S1 和S2 亞基，從而激活S 蛋白，促進非胞內體途徑進入［16-17］。脫殼：穿入之后冠狀病毒在宿主細胞內解體，將核衣殼和病毒RNA釋放到細胞質中（圖2②）。核酸和蛋白質合成：在核酸和蛋白質合成階段，ORF1a/b 翻譯為pp1a 和pp1ab（圖2③），病毒基因組RNA 開始復制（圖2④）［8］。pp1a 和pp1ab 被PLpro 和3CLpro 裂解產生大量非結構蛋白，并形成復制-轉錄復合物。冠狀病毒復制-轉錄復合物的疏水結構域附著在內質網(wǎng)膜上，產生冠狀病毒復制結構［18-19］。病毒基因組RNA的全長正鏈轉錄形成全長負鏈模板，負鏈模板用于合成新的全長基因組RNA［3，8］。病毒復制結構合成亞基因組RNA（subgenomic RNA）和各種結構蛋白的mRNA（圖2⑤），并產生結構蛋白和輔助蛋白（圖2⑥）［3，8］。裝配和釋放：最后在裝配和釋放階段，N蛋白和全長基因組RNA組裝形成螺旋狀核衣殼，核衣殼與S蛋白、E蛋白和M蛋白形成組裝的成熟病毒（圖2⑦和⑧），組裝完成的病毒通過胞吐釋放到細胞外，繼續(xù)新的病毒復制周期（圖2⑨）［6］。

圖1 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）基因組結構和刺突糖蛋白（S蛋白）介導的與宿主細胞融合.A：SARS-CoV-2基因組結構及其蛋白組成；其中數(shù)字表示基因組結構堿基序列位置，數(shù)字～數(shù)字表示編碼蛋白的基因組區(qū)間；B：S蛋白通過不同構象實現(xiàn)與細胞受體結合介導膜融合.ACE2：血管緊張素轉換酶2；RBD：受體結合域；PLpro：木瓜蛋白酶樣蛋白酶；3CLpro：3-胰凝乳樣蛋白酶；RdRp：RNA依賴性RNA聚合酶；E蛋白：包膜蛋白；M蛋白：膜蛋白；N蛋白：核衣殼蛋白.

2 靶向SARS-CoV-2與相關藥物研發(fā)

SARS-CoV-2 是一種高度宿主依賴的病原體，因此靶SARS-CoV-2 病毒本身或靶向宿主的治療手段都可發(fā)揮作用。針對SARS-CoV-2的吸附、穿入、脫殼、核酸和蛋白質合成、裝配和釋放5 個步驟的每個階段都可實現(xiàn)抗病毒效果。目前針對病毒結構蛋白（圖2a）、病毒的酶（圖2b）、病毒的復制復合體（圖2c）和病毒核酸、核苷酸及脂質膜（圖2d）的藥物研究取得了一定進展。由于病毒的生命周期本身高度依賴宿主，因此針對宿主在各階段發(fā)揮作用的分子也可產生抗病毒效果。目前針對參與病毒入侵的膜受體和蛋白酶（圖2e）、細胞內吞作用（圖2f）、其他參與病毒復制的信號通路（圖2g）以及免疫調節(jié)（圖2h）（表1）［6］的藥物研究取得一定進展。

2.1 病毒自身靶點及其相關藥物

冠狀病毒整個生命周期中可作為靶點的分子包括病毒的結構蛋白、非結構蛋白（包括關鍵的酶以及由非結構蛋白構成的復制復合體）以及病毒的核酸。這些分子共同組成病毒來源的COVID-19治療靶點。下面將分別敘述這些靶點的靶向藥物。

2.1.1 病毒結構蛋白靶點及其相關藥物

感染性病毒顆粒中的結構蛋白可以作為抗病毒藥物的靶點。根據(jù)冠狀病毒的結構可知其主要結構蛋白包括S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白（圖2a），其中S 蛋白作為冠狀病毒進入宿主細胞的重要蛋白可與宿主細胞表面受體結合，幫助病毒進入宿主細胞［9，20-22］。因此，以S 蛋白為靶點是抗冠狀病毒藥物研發(fā)的重要策略。

圖2 SARS-CoV-2復制周期及藥物靶向策略.CD147：基質金屬蛋白酶誘導子；TMPRSS2：跨膜蛋白酶絲氨酸2；ERK：細胞外調節(jié)蛋白激酶；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；Akt：蛋白激酶B；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；IL-1：白細胞介素1；?：病毒復制周期涉及的步驟；—：藥物靶向策略.

針對S 蛋白的抗體在SARS-CoV 和MERSCoV 病毒中已經(jīng)表現(xiàn)出抗病毒活性。在SARSCoV研究中，部分SARS 患者在癥狀發(fā)作后接受恢復期患者血漿治療后出院率顯著升高，且死亡率降低，而這些血漿中含有靶向SARS-CoV-S 的抗體［23-24］。在MERS-CoV研究中發(fā)現(xiàn)，對于利用腺病毒載體表達人源DPP4基因的MERS-CoV 感染的BALB/c 小鼠模型，含MERS-CoV-S 抗體的血清可以阻斷病毒附著并加速體內病毒的清除［25］。在SARS-CoV-2 S 蛋白抗體研發(fā)中發(fā)現(xiàn)，人源化單克隆抗體H014 可在nmol 水平通過與S 蛋白RBD 結合以中和SARS-CoV-2，并在ACE2 人源化小鼠模型中降低感染肺部的病毒滴度，預防肺部病變［26］。單克隆抗體COV2-2196 和COV2-2130 也能夠靶向RBD，阻斷病毒與ACE2 受體結合，并在小鼠和恒河猴模型得到驗證［27］。對于病毒頻繁突變可能產生的耐藥問題，可能通過多抗體聯(lián)合治療的方法解決。已有研究表明，2 種或以上靶向非交叉耐藥表位或S蛋白不同區(qū)域的單克隆抗體有助于減少病毒突變導致的免疫逃逸現(xiàn)象［28］。

靶向S 蛋白的多肽藥物也具有抗病毒活性，提示這類藥物在COVID-19防治中具有良好的應用前景。在抗SARS和MERS的體外藥物實驗中，針對S蛋白的抗病毒肽類均顯著減少感染導致的細胞空斑形成［29-30］。而在MERS感染的小鼠模型中，抗病毒肽HP2P-M2表現(xiàn)出保護作用，且與干擾素β聯(lián)合使用時具有增效作用［31］。靶向S 蛋白的多肽藥物對SARS-COV-2 感染也具有對抗作用，基于SARS-CoV和MERS-CoV的抑制劑EK1開發(fā)的脂肽EK1C4，體外應用對SARS-CoV-2膜融合過程有顯著抑制作用，并能保護小鼠模型不受HCoVOC43 感染，提示其對SARS-CoV-2 感染的防治作用［32］。針對S 蛋白不同區(qū)域的抗病毒肽可具有協(xié)同作用，并克服病毒的耐藥突變［33］。

靶向S蛋白的其他蛋白類藥物在冠狀病毒感染模型上也表現(xiàn)出治療效果。如格瑞弗森（griffithsin）是從一種紅藻中分離得到的抗病毒蛋白［34］，能與冠狀病毒S蛋白上的寡糖特異性結合［35］，并在體外模型和感染SARS-CoV 的小鼠模型中表現(xiàn)出對冠狀病毒的抑制作用。然而其對SARS-CoV-2 的治療效果尚未見報道。

靶向S蛋白的小分子藥物也同樣受到關注。如在體外實驗中，阿比朵爾（arbidol）具有抗SARS-CoV 的活性［36］，其可能通過作用于S 蛋白發(fā)揮作用。阿比朵爾也在COVID-19患者中進行了臨床試驗。來自69例COVID-19患者的臨床數(shù)據(jù)顯示，阿比朵爾治療組病死率（0%）明顯低于未使用阿比朵爾組（16%）［37］。然而后續(xù)也有研究顯示阿比朵爾并未表現(xiàn)出明確藥效［38］。

表1 冠狀病毒靶點和具有潛在作用的藥物

續(xù)表1

冠狀病毒其他的結構蛋白，包括E蛋白、M蛋白和N 蛋白，不僅是病毒組裝必需的蛋白，而且部分蛋白還具有抑制宿主免疫反應以促進病毒復制的功能。例如，SARS-CoV-M蛋白具有干擾素拮抗活性，SARS-CoV-N 蛋白可抑制由shRNA 或siRNA觸發(fā)的RNA 干擾［39-40］，且靶向SARS-CoV E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白，ORF3a，ORF7a 或ORF7b 的siRNA 能夠抑制病毒在體外模型中的復制［41］，說明S蛋白以外的結構蛋白也可能成為抗病毒靶點。目前已發(fā)現(xiàn)部分靶向E 蛋白和N 蛋白的化合物具有一定抗病毒活性，如SARS-CoV 和HCoV 229E 的E蛋白抑制劑阿米洛利（amiloride），與HCoV-OC43中N 蛋白的N 端結構域結合的PJ34 等［42-44］。然而總的看來，以S 蛋白以外的其他結構蛋白為靶點的藥物研究仍然較少，是否具有良好的研發(fā)前景目前尚難判斷。

2.1.2 病毒酶靶點及其相關藥物

病毒基因組除編碼結構蛋白外，還編碼了大量的非結構蛋白，其中病毒酶在病毒生命周期發(fā)揮重要作用（圖2b），是潛在的治療靶點，包括蛋白水解酶和復制酶等。在病毒的生命周期中，蛋白水解酶類的PLpro 和3CLpro 通過水解病毒的復制酶多聚蛋白，產生的大量非結構蛋白，進而形成病毒的復制；RdRp 和解旋酶在病毒的復制復合物過程中分別催化RNA 合成和RNA 雙鏈解旋過程。PLpro、3CLpro、RdRp 和解旋酶在病毒生命周期中的重要作用決定了它們極可能成為有效的抗病毒靶點，針對這些病毒酶的靶向藥物研發(fā)也取得了一定的進展。

PLpro 作為冠狀病毒的一個關鍵蛋白水解酶，在多聚蛋白水解、去泛素化等方面發(fā)揮作用［45-47］。病毒PLpro蛋白的晶體結構解析促進了對PLpro蛋白功能的了解和靶向分子的發(fā)現(xiàn)［48］，然而目前發(fā)現(xiàn)的某些SARS-CoV 的PLpro 抑制劑卻不能抑制病毒復制［49-51］。而且不同的冠狀病毒（例如SARSCoV 和MERS-CoV）的PLpro 蛋白結構具有差異，目前發(fā)現(xiàn)的PLpro 抑制劑無法發(fā)揮廣譜作用［52-53］。因此，針對SARS-CoV-2 的PLpro 靶向藥物研究應關注其PLpro 蛋白與其他病毒的同源性，及其在細胞和動物模型中的活性。

3CLpro 是另一種冠狀病毒病毒復制所需要的水解酶，可通過分解病毒復制中產生的復制酶多聚蛋白發(fā)揮作用。已有研究表明，多種藥物可靶向SARS的3CLpro蛋白［54］，部分抑制劑在體外實驗中表現(xiàn)出廣譜的抗冠狀病毒活性［55-56］。已經(jīng)上市的用于治療HIV 感染的蛋白酶抑制劑洛匹那韋是一種3CLpro抑制劑，在多種體內外實驗中表現(xiàn)出單用或聯(lián)合使用的抗MERS-CoV 或SARS-CoV 活性［25，57-61］。針對SARS-CoV-2 的3CLpro 蛋白的晶體結構解析和藥物篩選也發(fā)現(xiàn)部分能夠抑制3CLpro蛋白活性的小分子，其中依布硒（ebselen）在細胞模型中表現(xiàn)出活性［62］。

參與病毒轉錄和復制的RNA 依賴性RdRp 是冠狀病毒復制-轉錄復合物的重要組成部分，參與基因組和亞基因組RNA 的產生。核苷（酸）類似物通過抑制RdRp的功能發(fā)揮作用。核苷類似物利巴韋林（ribavirin）是一種具有廣譜抗病毒活性的鳥嘌呤類似物，用于治療嚴重呼吸道合胞病毒感染、丙型肝炎病毒感染和病毒性出血熱，其確切的作用機制尚不清楚，但抑制mRNA 加帽和誘導RNA 依賴性病毒復制中的突變對治療包括冠狀病毒在內的多種RNA病毒感染至關重要［63］。細胞實驗結果表明，利巴韋林在體外能夠抑制SARS-CoV-2復制［4］。然而，用利巴韋林治療SARS患者和MERS患者的結果并未顯示出明顯的臨床獲益［64-67］。此外，使用大劑量利巴韋林的嚴重副作用也限制了其在嚴重冠狀病毒感染患者中的臨床應用［2，64］。腺苷類似物BCX4430 作為一種非專一的RNA 鏈終止劑，可抑制多種RNA 病毒的RdRp，包括SARS-CoV 和MERS-CoV等冠狀病毒以及埃博拉和馬爾堡病毒等絲狀病毒［68］。其他核苷類似物，如阿昔洛韋（aciclovir）在體外可抑制MERS-CoV 和HCoV-NL63［69］。2014 年，法匹拉韋在日本批準上市，用于甲型和乙型流感的治療，其安全性良好［70］。研究表明，法匹拉韋在體外對SARS-COV-2 有一定的抑制作用［4］。且在深圳開展的一項開放性非隨機對照研究中顯示，其對COVID-19 疾病進展和病毒清除具有作用，法匹拉韋治療組病毒清除中位時間更短（內距2.5～9.0 d），與對照組（內距8.0～13.0 d）相比差異顯著（P<0.01），法匹拉韋治療組胸部CT 改善率（91.43%）也顯著高于對照組（62.22%）（P=0.004）［71］。法匹拉韋仿制藥阿維法韋（avifavir）已在俄羅斯獲批用于COVID-19 治療（https：//rdif.ru/Eng_full-News/5224/），而印度也批準了法匹拉韋用于輕度至中度COVID-19 患者的治療（https：//www.glenmarkpharma.com/sites/default/files/Indian-regulatorapproves-Favipiravir-for-the-treatment-of-mild-tomoder.pdf）。瑞德西韋作為靶向RdRp 的抗RNA病毒的新型核苷類似物被廣泛關注并嘗試用于治療SARS-CoV-2感染［4，72-73］。晶體結構研究表明瑞德西韋對SARS-CoV-2 的RdRp 具有靶向作用［74］。瑞德西韋較早開展用于治療COVID-19 的臨床研究［75］。在中國的一項雙盲安慰劑對照臨床試驗（注冊號：NCT04257656）中，瑞德西韋不能使COVID-19重癥患者明顯獲益，但在癥狀持續(xù)時間≤10 d的患者中，瑞德西韋治療組的臨床改善時間比安慰劑組更短（風險比1.52，95%置信區(qū)間為［0.95～2.43］）［76］。而美國的一項RCT 研究以及一項國際的同情用藥試驗則支持瑞德西韋對COVID-19患者的臨床獲益，瑞德西韋組患者的中位恢復時間為11 d，顯著小于安慰劑組的15 d（P<0.01）［77］。2020年5月1日，美國食品藥品管理局宣布瑞德西韋獲得緊急使用授權（emergency use authorization）。隨后，日本、印度、英國和歐盟等也批準了瑞德西韋用于COVID-19治療或緊急使用。然而瑞德西韋抗SARS-CoV-2 的作用和安全性等還有待進一步觀察和研究。一種新的核苷類似物EIDD-1931在細胞模型上表現(xiàn)出對SARS-CoV-2 及其他病毒的抑制作用，并且對瑞德西韋耐藥的病毒依然有效?？诜淝绑w藥物EIDD-2801 可抑制冠狀病毒感染的小鼠模型體質量降低和肺部出血現(xiàn)象［78］。與其他病毒靶標類似，冠狀病毒RdRp 的突變可導致耐藥性問題。除核苷類似物外，靶向RdRp 的siRNA分子對SARS-CoV也有抑制作用，然而由于siRNA遞送困難，尚難進行臨床應用［79-80］。

解旋酶在冠狀病毒復制周期中催化雙核苷酸鏈解旋成單鏈。由于不同冠狀病毒的解旋酶高度同源，針對解旋酶的抑制劑可具有廣譜活性。解旋酶抑制劑根據(jù)其作用機制差別可分為ATP 酶活性和非ATP 酶活性2 種不同類型。其中靶向ATP 酶發(fā)揮活性的某些抑制劑，如巴拿寧（bananins）和2，6-雙芳甲氧-5-羥色酮（2，6-bis-arylmethyloxy-5-hydroxychromones）可在體外抑制SARS-CoV 復制［81-82］。然而，這些化合物對細胞ATP酶或激酶的抑制所產生的毒性不利于臨床應用。而非ATP 酶活性的冠狀病毒螺旋酶抑制劑如SSYA 10-001，可選擇性抑制螺旋酶的解旋活性，從而抑制包括SARS-CoV 和MERS-CoV 等在內的多種冠狀病毒［83-84］。因此，針對SARS-CoV-2的解旋酶研發(fā)非ATP 酶活性的抑制劑，有利于減小副作用，提高成藥性。

2.1.3 病毒復制復合體靶點及其相關藥物

病毒的復制復合體由多種非結構蛋白組成，由于病毒的核酸合成依賴于冠狀病毒復制復合物。因此，以該復合體為靶點進行治療可起到抗病毒作用（圖2c）。針對病毒復制復合體進行抗病毒研發(fā)的研究較少。已發(fā)現(xiàn)針對該復合物的藥物K22 在體外實驗中表現(xiàn)出對多種冠狀病毒的抑制活性，而對組成復合體的非結構蛋白NSP6 發(fā)生突變的HCoV 229E 病毒則表現(xiàn)出耐藥性［18］，提示該藥物作用靶點與該蛋白有關。由于復制復合體組成復雜，針對哪些非結構蛋白設計藥物可發(fā)揮抗病毒作用仍不明確，為相關藥物的研發(fā)帶來了一定困難。

2.1.4 靶向病毒核酸、核苷酸和脂質膜的藥物

SARS-CoV-2 病毒的生命周期中除了上述蛋白外，核酸及組成核酸的核苷酸以及其結構中的脂質膜均發(fā)揮了重要作用（圖2d）。針對這些非蛋白類靶點進行藥物研發(fā)也可具有抗病毒作用。

核酸和核苷酸作為SARS-CoV-2 的遺傳物質和結構單元，承載著病毒的基因組信息，并在蛋白合成中發(fā)揮作用。靶向核苷或核苷酸的藥物通常具有廣譜抗病毒活性。霉酚酸酯通過非競爭性可逆性抑制嘌呤核苷酸從頭合成途徑，使鳥嘌呤核苷酸耗竭，其作為一種對乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和登革病毒等具有廣泛抗病毒作用的藥物，在體外模型中表現(xiàn)出對冠狀病毒的抑制活性［85］。然而在MERS-CoV 感染的動物模型中卻表現(xiàn)出加重感染的癥狀［61］，這可能與其強烈抑制T 淋巴細胞和B 淋巴細胞增殖作用相關。因此，單獨使用這類藥物在整體水平未必起到很好的治療作用。

靶向核酸的藥物主要是RNA酶。RNA酶作為催化特定生化反應的RNA分子，在體外篩選模型中可以抑制冠狀病毒RNA 表達［86］。然而由于這類分子會在體內迅速降解導致其難以應用于臨床治療。

SARS-CoV-2 作為一種包膜病毒，脂質膜是形成病毒結構的重要組成部分，針對病毒脂質膜的靶向藥物也可發(fā)揮抗病毒作用。LJ001和LJ103通過產生單態(tài)氧分子破壞病毒脂質膜，對多種冠狀病毒有抑制作用，有潛力成為一類新的抗病毒藥物［87-90］。

2.2 宿主靶點及其相關藥物

2.2.1 膜受體和蛋白酶靶點及其相關藥物

SARS-CoV-2 利用特定的宿主受體和蛋白酶進入細胞并復制（圖2e）。靶向參與病毒入侵的膜受體和蛋白酶進行藥物研發(fā)可抑制冠狀病毒的感染。

病毒利用的宿主受體可通過特異性抗體、肽或功能性抑制劑進行靶向干預。DPP4 是MERSCoV入侵依賴的膜受體，DPP4單抗可抑制MERSCoV 進入細胞［91］。ACE2 是SARS-CoV 和SARSCoV-2 入侵依賴的膜受體，在SARS-CoV 的治療中，小分子進入抑制劑N-（2-氨基乙基）-1-氮雜環(huán)丙烷胺〔N-（2-aminoethyl）-1-aziridineethanamine，NAAE〕在體外實驗中抑制ACE2 介導的細胞融合［92］。在SARS-CoV-2 治療的體外實驗中，抗CD147 人源化抗體美泊珠單抗（meplazumab）可抑制SARS-CoV-2 進入宿主細胞［13］。重組人可溶性ACE2在細胞模型中可以顯著抑制SARS-CoV-2感染能力，在小鼠模型無效果，但對于工程化的人血管和腎器官，可抑制其感染，提示重組人可溶性ACE2可用于阻斷SARS-CoV-2早期感染［93］。然而針對這些受體的藥物尚未在人體上證明有效，而應用這類藥物時需要綜合考慮這些靶點本身在人體的基本生理作用以及免疫方面的副作用。

冠狀病毒通過2 種不同途徑，即胞內體途徑和非胞內體途徑進入宿主細胞［3］。胞內體途徑需要依賴宿主的蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶，其抑制劑如K11777可以抑制冠狀病毒的胞內體入侵［94］。半胱氨酸蛋白酶抑制劑可對多種有包膜RNA 病毒表現(xiàn)出抗病毒活性［94-97］。而絲氨酸蛋白酶TMPRSS2介導冠狀病毒非胞內體進入途徑，其抑制劑卡莫司他（camostat）在體外實驗中表現(xiàn)出對SARS-CoV，MERS-CoV 和SARS-CoV-2 的抑制活性，并提高SARS-CoV感染模型小鼠存活率［16-17，94］。弗林蛋白酶在MERS-CoV進入中也起重要作用，阻斷弗林蛋白酶可以在MERS-COV的體外模型中抑制病毒進入和細胞融合［98］。針對SARS-CoV-2 胞內體途徑進入細胞所依賴的蛋白酶進行藥物干預，可取得一定的治療效果，但由于病毒進入細胞途徑多樣，利用的蛋白酶種類亦多樣，因此，單獨干預可能效果有限，臨床應用時可考慮多藥聯(lián)用以增強藥效。

靶向宿主內參與病毒入侵的膜受體和蛋白酶的藥物可抑制冠狀病毒進入宿主細胞從而發(fā)揮抗病毒作用，但可能給宿主帶來副作用，應考慮與不同機制的藥物聯(lián)合使用。如使用不同藥物分別阻斷病毒的胞內體途徑或非胞內體途徑，可能取得更優(yōu)的效果。

2.2.2 細胞內吞作用靶點及其相關藥物

在SARS-CoV-2的胞內體途徑中，病毒通過細胞內吞作用進入細胞并釋放病毒核酸，開始細胞內的生命周期。靶向這一途徑也有利于冠狀病毒的防治（圖2f）?？汞懠菜幬锫揉瓕①|子隔離到溶酶體中以增加細胞內pH 值，從而抑制內吞作用。它在體外對多種冠狀病毒和其他RNA 病毒具有廣譜抗病毒活性［59，99-101］。體外細胞模型的受體可能會影響活性評價結果，在介導非胞內體途徑的TMPRSS2 陽性細胞上，氯喹和羥氯喹不能阻斷SARS-CoV-2感染，這可能與其無法阻斷非胞內體進入途徑有關［5］。氯喹和羥基氯喹用于COVID-19治療的臨床實驗開展較早，影響較大［102］。在中國開展的一項30例患者參與的前瞻性臨床試驗中，羥氯喹治療組在體溫變化，胸部CT改善等各方面均未表現(xiàn)出與對照組的顯著差異［103］。而一項納入1376例患者的大樣本觀察性研究結果表明，相比未服用的患者，服用羥氯喹的患者插管或死亡的風險無顯著降低（風險比1.04，95%置信區(qū)間為［0.82～1.32］）［104］。網(wǎng)格蛋白是另一個內吞作用靶點，氯丙嗪（chlorpromazine）作為一種已上市的精神類藥物，可以抑制網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用。該藥物在體外實驗中表現(xiàn)出對冠狀病毒的抑制活性［59］。然而這些藥物在臨床是否具有較好的抗病毒效果仍然需要進一步實驗驗證，同時應注意相關藥物使用帶來的副作用。

2.2.3 其他參與病毒復制信號通路的靶點及其相關藥物

SARS-CoV-2 在進入細胞進行病毒復制的過程中也利用其他細胞信號通路，這些通路也是潛在的治療靶點（圖2g）。親環(huán)素（cyclophilin）與SARS冠狀病毒非結構蛋白1（nonstructural protein 1，NSP1）相互作用，調節(jié)鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑，參與病毒復制，并在T 細胞介導的適應性免疫應答中起重要作用［35］。鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢霉素能夠在體外廣泛抑制冠狀病毒感染［35，105-106］。而環(huán)孢霉素對免疫系統(tǒng)的抑制作用限制了它的臨床應用。非免疫抑制的鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑，如阿拉泊韋（alisporivir）表現(xiàn)出對人冠狀病毒NL63的抑制活性［107］。調節(jié)其他細胞信號通路的藥物，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等相關通路的抑制劑，也發(fā)現(xiàn)具有抗冠狀病毒活性［108-109］。將這些宿主靶向的抗病毒藥物用于治療冠狀病毒感染時應充分考慮其副作用。

2.2.4 免疫調節(jié)靶點及其相關藥物

除以上SARS-CoV-2 生命周期內會利用的宿主蛋白外，調節(jié)宿主的免疫功能也有助于感染防治（圖2h）。宿主應對病毒的免疫反應可分為非特異免疫和特異免疫。

非特異免疫是宿主應對感染的重要屏障。其中宿主固有的干擾素應答對包括SARS-CoV-2 在內的多種冠狀病毒感染至關重要［110］。針對非特異免疫的治療藥物主要包括干擾素和天然免疫調節(jié)劑，它們與有效抗病毒藥物的聯(lián)合應用具有協(xié)同作用。

盡管冠狀病毒能夠削弱或逃避干擾素作用。但體外實驗中干擾素治療仍然有效［111-112］。重組α干擾素和β 干擾素在體外和動物模型中均可抑制SARS-CoV和MERS-CoV的復制［2，31，61，84，113-117］。干擾素α或干擾素β與其他抗病毒藥物的各種組合已被用于治療SARS或MERS患者。

天然免疫調節(jié)劑可誘導干擾素產生，從而發(fā)揮防治效果。聚肌苷酸-聚胞苷酸作為人工合成的核苷酸二聚物，能強烈誘導Ⅰ型干擾素產生。在利用腺病毒載體表達人源DPP4基因的MERS-CoV 感染的BALB/c 小鼠中，MERS-CoV 的病毒載量顯著降低［25］。該藥物在針對惡性膠質瘤的Ⅱ期臨床試驗中具有良好的耐受性［118-119］。獼猴θ 型防御素-1參與宿主病毒感染相關的免疫調控作用，在動物模型中具有抗SARS-CoV作用［120］。

特異免疫對于COVID-19 患者治療也非常重要，參與特異免疫的白細胞介素1 和相關促炎通路對感染者的預后有一定的提示作用，是治療SARSCoV-2 的一個候選靶點［121］。白細胞介素6 作為在細胞因子釋放綜合征中重要的靶點，其抗體托珠單抗（tocilizumab）已在臨床用于COVID-19重癥患者的救治［122-123］。已發(fā)表的臨床試驗結果中托珠單抗和標準治療患者的臨床改善和死亡率無統(tǒng)計學差異，其有效性和安全性仍有待進一步實驗確證［124］。

在應用其他抗病毒藥物進行COVID-19 治療時，應考慮聯(lián)合使用免疫干預手段，以起到協(xié)同增效作用。對于重癥患者，應綜合考慮免疫反應帶來的優(yōu)勢與劣勢，重點關注過強的免疫反應帶來的嚴重后果。

3 對SARS-CoV-2靶點和藥物研究的思考

長期以來，冠狀病毒作為一種引起人類輕度感染的病毒并未受到醫(yī)學研究機構的較多關注。自2002年末SARS暴發(fā)以來，冠狀病毒開始受到全世界的重視［6］。由于尚缺乏針對冠狀病毒感染的有效藥物，充分認識病毒的感染和致病機制將為研發(fā)冠狀病毒治療藥物提供幫助。

抗病毒靶點包括病毒靶點和與病毒密切相關的宿主靶點。雖然抗冠狀病毒候選靶點很多，但目前關注和研究所聚焦的病毒靶點主要是冠狀病毒S蛋白及RdRp。S 蛋白作為病毒與宿主細胞結合的關鍵蛋白，在病毒入侵宿主細胞過程中具有重要作用，是一個非常被看好的抗病毒靶點，但是尚無針對該靶點的特效藥問世，仍需更多實驗和臨床療效評價結果證明。在抗流感病毒藥物研發(fā)過程中，靶向流感病毒與宿主細胞結合的血凝素的藥物研發(fā)未能成功，但靶向病毒神經(jīng)氨酸酶和M2 離子通道的抑制劑具有良好的抗病毒效果，針對這2 個靶點的藥物均已成功上市，如神經(jīng)氨酸酶抑制劑磷酸奧司他韋是當前抗流感病毒的特效藥物。因此，在抗SARS-CoV-2藥物研發(fā)中還應考慮S蛋白以外的靶點，如E 蛋白和M 蛋白等。另一類受關注的靶點RdRp 在SARS-CoV-2 復制過程中起關鍵作用，該靶點受關注的主要原因是現(xiàn)有RdRp抑制劑具有廣譜抗病毒作用，在體外抗病毒實驗及臨床試驗中表現(xiàn)出了良好的效果，如法匹拉韋和瑞德西韋［71，75］。因此，已經(jīng)存在的靶向其他病毒RdRp 抗病毒藥物也可能對SARS-CoV-2有效。

關于宿主靶向的藥物研究相對較少。在抗SARS-CoV-2研究中發(fā)現(xiàn)，氯喹和羥氯喹雖然能夠抑制細胞內吞作用，但由于SARS-CoV-2 可以由TMPRSS2 介導非胞內體途徑進入細胞，因此氯喹或羥氯喹無法完全阻斷SARS-CoV-2 進入細胞［5］。為了獲得較好的細胞保護作用，氯喹或羥氯喹與TMPRSS2抑制劑聯(lián)用或許是一個更好的方案。

研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19 重癥患者死亡的重要原因是SARS-CoV-2 感染引發(fā)了細胞因子風暴。雖然靶向白細胞介素6 的抗體藥物托西珠單抗用于COVID-19重癥患者治療的SARS-CoV-2臨床試驗失敗，但是對于感染者免疫系統(tǒng)反應的恰當干預仍然可能成為治療COVID-19的重要手段。不同人群感染后發(fā)展為重癥的概率差異很大，如肥胖者發(fā)展為重癥的概率是正常體質量患者的3.4倍以上［125］，兒童感染后相比于成年人更少發(fā)展為重癥［126］，提示患者本身在代謝與免疫方面的差異可能直接導致了不同的感染結局。運用傳統(tǒng)中醫(yī)療法的江夏方艙醫(yī)院收治的564例COVID-19患者無1例轉為重癥，或許與傳統(tǒng)中醫(yī)對代謝和免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用相關［127］。因此，深入研究SARS-CoV-2 引發(fā)的免疫反應機制及調控免疫應答反應的關鍵環(huán)節(jié)，尋找有效的干預靶點，開發(fā)新型免疫療法，對于有效發(fā)揮機體免疫系統(tǒng)抗病毒的能力、提高COVID-19 的治療效果具有重要意義。

新發(fā)病原體往往存在基因關鍵位點的突變，所儲備的抗病毒藥物，尤其是靶向病毒的藥物，仍然難以直接用于新病毒的防治。因此，為了增強對新型病毒的應對能力，一方面應當加強適用范圍廣的抗病毒藥物即廣譜抗病毒藥物的研發(fā)，在突發(fā)疫情到來時可快速作為候選藥物進行驗證篩選。發(fā)現(xiàn)和確證有效的廣譜抗病毒靶點是研發(fā)廣譜抗病毒藥物的關鍵和難點，需要進一步加強病毒學、免疫學、生物信息學、藥理學和藥物化學等多學科與大數(shù)據(jù)、人工智能等新技術的密切合作，實施協(xié)同攻關，可望在廣譜抗病毒藥物研發(fā)方面取得新的突破。此外，充分發(fā)揮我國中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢，認真總結和分析防治COVID-19 等傳染病的經(jīng)驗，深入研究中藥治療傳染病的理念和作用機制，可望研發(fā)出具有獨特臨床價值的防治傳染病的中藥新藥。另一方面，進一步加強藥物重定位新技術的研究，不斷提高藥物重定位的準確性和效率，對于從已有藥物或化合物中尋找有效的抗病毒藥物具有重要意義。尤其是在應急情況下，藥物重定位技術是一條快速發(fā)現(xiàn)有效抗病毒藥物的重要途徑。因此，應當建立完善的應急藥物研發(fā)技術流程，在獲得病毒結構、序列、感染受體及致病特征等關鍵信息的第一時間，能夠迅速運用藥物重定位技術從已上市藥物或已有化合物中尋找有效的抗病毒候選藥物。此外，應大力發(fā)展基于計算分析及高通量篩選等新技術、新方法，不斷提高抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)的準確性和效率。