應(yīng)用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)測(cè)定肝細(xì)胞癌患者血清代謝組

王淑鳳，柏兆方，楊馨，王心正，何昆，王紅霞

（1.國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部，北京 100039）

肝癌是全球第五大最常見癌癥，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。2018年約有84萬(wàn)新發(fā)病例和78萬(wàn)死亡病例［1］，超過(guò)90%的原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。80%HCC 是由肝硬化（liver cirrhosis，LC）發(fā)展而來(lái)的，而LC 向HCC 的惡性轉(zhuǎn)變往往是致命的，部分原因是在HCC 的進(jìn)展階段，缺乏特異、靈敏的診斷標(biāo)志物。血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和肝超聲檢查是HCC早期常規(guī)監(jiān)測(cè)篩查指標(biāo)，但臨床診療實(shí)踐表明，AFP 持續(xù)升高僅是發(fā)生HCC 的危險(xiǎn)因素，有30%～40%HCC患者AFP檢測(cè)呈陰性。目前通過(guò)肝影像和AFP測(cè)定診斷HCC的方法缺乏足夠的敏感性和特異性。影像學(xué)檢查包括電子計(jì)算機(jī)斷層成像、磁共振和超聲檢查，雖然對(duì)HCC 的準(zhǔn)確診斷具有重要作用，但總體而言影像學(xué)技術(shù)的靈敏度、準(zhǔn)確性和人為操作依賴性等還不能滿足HCC早期診斷的需要［3-5］。肝中的再生結(jié)節(jié)與早期腫瘤很相似，且AFP水平升高，這一特點(diǎn)導(dǎo)致對(duì)LC引起的HCC的診斷具有很大的挑戰(zhàn)性［6］。因此，迫切需要在LC患者的高危人群中發(fā)現(xiàn)更可靠、更準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)志物，以提高早期HCC的診斷率。

代謝組學(xué)是通過(guò)高通量的分析技術(shù)來(lái)識(shí)別、定量和表征生物系統(tǒng)中內(nèi)源性的小分子代謝物（相對(duì)分子質(zhì)量<1800）。腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)是代謝組學(xué)的重要應(yīng)用領(lǐng)域，目的是識(shí)別與各種疾病和環(huán)境暴露相關(guān)的代謝產(chǎn)物，是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的補(bǔ)充［7-8］。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）技術(shù)是代謝組學(xué)研究的重要技術(shù)，在識(shí)別各種腫瘤研究中基于代謝的生物標(biāo)志物方面具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣等明顯優(yōu)勢(shì)［9］。由于代謝產(chǎn)物的變化被認(rèn)為是腫瘤的特征之一［10］，并且腫瘤細(xì)胞的代謝重編程對(duì)其快速增殖很重要［11-13］，因此通過(guò)研究HCC患者的血清代謝物變化，有望找到理想的早期診斷標(biāo)志物及新的藥物靶標(biāo)。雖然HCC 血清代謝組學(xué)研究已廣泛開展［14-25］，但由于這些研究開展比較早，限于當(dāng)時(shí)質(zhì)譜技術(shù)的局限性，所鑒定的差異代謝物相對(duì)較少。更為重要的是目前尚無(wú)新的代謝標(biāo)志物應(yīng)用于臨床檢測(cè)。因此，本研究采用目前最靈敏的高分辨質(zhì)譜儀TripleTOFTM6600結(jié)合超高效液相色譜法的2種分離方式——反相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）和親水色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）對(duì)50 例HCC 患者和50 例LC 患者的血清代謝組進(jìn)行深度分析，探究HCC 血清代謝組變化，為尋找高靈敏度高特異性的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高分辨電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀TripleTOFTM6600（Sciex，美國(guó)）；LC-30AD 液相色譜儀（SHIMADZU，日本）。水（質(zhì)譜級(jí)）和乙腈（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲酸（純度98%）購(gòu)于比利時(shí)Acros Organics公司。

1.2 血清樣本

50 例HCC 患者和50 例LC 患者血清由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部于2012 年9 月-2014 年12 月收集。所有患者均簽署知情同意書，研究協(xié)議得到該醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有血清樣本于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。所有受試者的臨床數(shù)據(jù)見表1。

1.3 血清代謝物提取

所有血清4℃解凍后，取上層血清100 μL 加至1.5 mL離心管中，再加入4倍-80℃預(yù)冷的乙腈：甲醇（1∶1）溶液，渦旋30 s，冰浴超聲10 min，置于-20℃沉淀。1 h 后離心10 min（13 523×g，4℃），取上清，真空離心干燥后置于-80℃待質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析時(shí)，用10%甲醇水溶液（0.1%甲酸）100 μL復(fù)溶樣品，冰浴超聲10 min，離心10 min（13 523×g，4℃）后取上清進(jìn)行分析。

1.4 色譜條件

1.4.1 反相色譜

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters，美國(guó)）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1.5 min，1%B；1.5～20.0 min，1%B～99%B；20.0～25.0 min，99%B；25.0～25.1 min，99%B～1%B；25.1～30.0 min，1%B。

Tab.1 Clinical data of patients enrolled in non-targeted metabolomic study

1.4.2 親水色譜

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），（Waters，美國(guó)）；柱溫：40℃，進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相A：10%（體積分?jǐn)?shù)）水/乙腈溶液，含10 mmol·L-1乙酸銨和0.1%甲酸；流動(dòng)相B：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，含10 mmol·L-1乙酸銨；流速：0.3 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%B；1.0～12.0 min，5%B～32%B；12.0～12.1 min，32%B～55%B；12.1～15.0 min，55%B；15.0～15.1 min，55%B～5%B；15.1～20.0 min，5%B。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，在正、負(fù)離子模式下分別檢測(cè)。數(shù)據(jù)采集方式為數(shù)據(jù)依賴采集模式，一次一級(jí)全掃描進(jìn)行12 次二級(jí)譜圖掃描。掃描范圍為50～1000 u，質(zhì)量偏差為50 ppm，離子源霧化氣Gas1和輔助氣Gas2 都為50 Pa，氣簾氣為35 Pa，溫度為500℃，噴霧電壓（ion spray voltage floating，ISVF）為5500 V/-4500 V，去簇電壓（declustering potential，DP）為80 V/-80 V，碰撞能量（collision energy，CE）為（30±15）eV。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 應(yīng)用Progenesis Ql 3.0.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

將UPLC-QTOF-MS/MS 采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)軟件Progenesis QI 3.0.3進(jìn)行分析，包含數(shù)據(jù)預(yù)處理和代謝物鑒定。數(shù)據(jù)預(yù)處理即自動(dòng)峰值提取、歸一化及背景扣除等。代謝物鑒定通過(guò)檢索人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Metabolome Database，HMDB）（https：//hmdb.ca/，2020-04-21）和Metlin 數(shù)據(jù)庫(kù)（美國(guó)Waters 公司，2020-04-21），根據(jù)分子質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確度，同位素相似性及二級(jí)碎片信息進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)量誤差為12 ppm。分值Score>40的代謝物為鑒定代謝物。

1.6.2 應(yīng)用EZinfo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析

將預(yù)處理的數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入EZinfo 軟件（Progenesis QI 插件）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和方差分析（analysis of variance，ANOVA）分析，對(duì)樣本代謝組的差異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化處理。通過(guò)PCA和OPLS-DA的得分圖分析組內(nèi)和組間樣本代謝組的差異性；根據(jù)變量重要性投影指標(biāo)（variable importance in the projection，VIP）≥1、P<0.05 和變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.5或≤0.67，篩選出組間顯著差異代謝物。

1.6.3 應(yīng)用MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行代謝通路分析

將篩選出的差異代謝物導(dǎo)入在線代謝組學(xué)分析工具M(jìn)etaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-QTOF-MS/MS的穩(wěn)定性

由于代謝組研究測(cè)試樣本通常比較多，UPLCQTOF-MS/MS 的穩(wěn)定性對(duì)獲得準(zhǔn)確可靠的差異代謝物非常重要。質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本用于評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。QC樣本由每個(gè)樣本2 μL混合組成。在樣本測(cè)定過(guò)程中每10個(gè)樣本中間分析一個(gè)QC樣品。圖1顯示了HILIC分離質(zhì)譜正離子檢測(cè)模式（HILIC positive mode，HILIC-POS）下QC樣本和所有患者樣本的PCA圖?？梢钥闯?，QC 樣本緊密聚集在一起，表明UPLC-QTOF-MS/MS 的重復(fù)性和穩(wěn)定性高，能夠保證測(cè)定數(shù)據(jù)的可靠性。通過(guò)PCA 得分圖看QC 樣本的聚集程度能夠直觀、快速判斷所采用技術(shù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.2 肝癌和肝硬化患者血清代謝譜

為提高代謝物的鑒定覆蓋率，每個(gè)患者血清的代謝物經(jīng)RPLC 和HILIC 分離后，分別用正負(fù)離子化方式檢測(cè)，共有4種分析方式。為便于描述，分別縮寫為RPLC-POS，RPLC-負(fù)離子檢測(cè)（RPLCnegative mode，RPLC-NEG），HILIC-POS 和HILIC-NEG。合并所有樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)，上述4種方式分別檢測(cè)到31 294，36 450，9 033和10 803個(gè)代謝特征譜峰，即由保留時(shí)間和精確質(zhì)荷比組成的一對(duì)數(shù)值。經(jīng)檢索HMDB和Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)，分別鑒定到3 474，4 082，1 279 和1 655 個(gè)代謝物，共鑒定7 848 代謝物。圖2 顯示了4 種分析模式檢測(cè)代謝物的重復(fù)性和互補(bǔ)性。上述數(shù)據(jù)表明，結(jié)合4 種分析模式，可以顯著提高代謝物鑒定的覆蓋率。

Fig.1 Principal component analysis（PCA）score plot of quality control（QC）samples and all patients′samples by hydrophilic interaction liquid chromatography（HlLlC）in positive ion mode.PCA score plot was performed using EZinfo software to evaluate the repeatability and stability of the method.The more clustered，the better the repeatability and stability.t［1］represents the first principal component，t［2］represents the second principal component.Each point represents a serum sample.

Fig.2 Venn diagram of identified metabolites in four analysis modes based on ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry（UPLC-QTOF-MS/MS）. All samples were separated via reversed phase liquid chromatography coupled with positive and negative mode electrospray ionization mass spectrometry（RPLC-POS，RPLC-NEG）and were separated via hydrophilic interaction liquid chromatography in positive and negative ion mode（HILIC-POS，HILIC-NEG）.Non-overlapping part of the figure is unique to each group，and the overlapping part is common to each group，and the numbers are shown.

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

無(wú)監(jiān)督的PCA分析可以降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，直觀地反映兩組數(shù)據(jù)之間的分離度及組內(nèi)數(shù)據(jù)的相似性。圖3 展示了4 種分析模式下HCC 和LC 的PCA 得分圖。PCA 得分圖反映了每個(gè)樣本在2 個(gè)主成分t［1］和t［2］組成的坐標(biāo)系中的分布，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本?？梢钥闯?種分析模式下2組的分離程度均不明顯。由于HCC和LC患者的發(fā)病機(jī)制及臨床癥狀有較高的相似性，因此血清代謝組相似性也較高，分離不明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。為尋找能區(qū)分HCC 和LC 患者的潛在代謝標(biāo)志物，本研究進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了有監(jiān)督的OPLS-DA 分析。圖4 為4 種分析模式的OPLS-DA 得分圖?？梢钥闯觯琀CC 和LC 患者在4 種分析模式下分離都很明顯。根據(jù)OPLS-DA，可以計(jì)算出每個(gè)代謝物的VIP 值，這是篩選差異代謝物的重要參數(shù)之一。同時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，可得到每個(gè)代謝物在2組之間的P值。

Fig.3 PCA score plot of hepatocellular carcinoma（HCC）and liver cirrhosis（LC）patients′ sera in four analysis modes. The PCA score plots of RPLC-POS（A），RPLC-NEG（B），HILIC-POS（C）and HILIC-NEG（D）were performed using EZinfo software to evaluate the degree of separation between HCC and LC groups，and the similarity within HCC group or LC group.This figure shows the distribution of each sample in the coordinate composed of two principal components t［1］and t［2］，and each point represents a serum sample.

2.4 差異代謝物篩選

為獲得可靠的差異代謝物，本研究采用了比較嚴(yán)格的篩選條件。首先，2組數(shù)據(jù)之間ANOVA分析P值<0.05；其次基于OPLS-DA 分析的VIP 值≥1；最后，HCC 與LC 比較，F(xiàn)C≥1.5 或≤0.67。應(yīng)用上述3 個(gè)條件篩選，RPLC-POS，RPLC-NEG，HILICPOS 及HILIC-NEG 分別得到154，162，61 和94 個(gè)差異代謝物，4種方式共定量差異代謝物438個(gè)，主要包括膽汁酸（18 個(gè)）、游離脂肪酸（34 個(gè)）、磷脂（46 個(gè)）和小肽（33 個(gè)）。這些差異代謝物的重復(fù)性和互補(bǔ)性見圖5。表2列出了最顯著的50個(gè)差異代謝物的信息。

2.5 通路分析

Fig.5 Venn diagram of differential metabolites in RPLC-POS，RPLC-NEG，HlLlC-POS and HlLlC-NEG modes.Venn diagram displays the differential metabolites in four analysis modes of all samples based on UPLC-QTOF-MS/MS.Non-overlapping part of the figure is unique to each group，the overlapping part is common to each group，and the numbers are shown.

為進(jìn)一步探究差異代謝物的生物學(xué)功能，對(duì)所有差異代謝物進(jìn)行了通路分析。圖6展示了通路分析結(jié)果。P<0.05 或影響值（pathway impact）≥0.1通常認(rèn)為差異顯著。符合上述條件的通路有12個(gè)，其中P<0.05的代謝通路是鞘磷脂代謝，其余包括三羧酸循環(huán)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘油磷脂代謝、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝通路的影響值均≥0.1，其中鞘磷脂代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、三羧酸循環(huán)和甘油磷脂代謝均顯著上調(diào)，代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò)見圖7。

Fig.6 Pathway analysis results obtained by Metabo-Analyst.Each bubble indicates one pathway.The bubble color was used to represent the P value of this metabolic pathway（the redder the bubble，the smaller the P value），and the bubble size was used to represent the pathway impact value（it was calculated by adding up the importance measures of each of the matched metabolites and then dividing by the sum of the importance measures of all metabolites in each pathway）.a：sphingolipid metabolism；b：phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis；c：riboflavin metabolism；d：glycerophospholipid metabolism；e：α-linolenic acid metabolism；f：sulfur metabolism；g：citrate cycle（TCA cycle）；h：β-alanine metabolism；i：tyrosine metabolism；j：cysteine and methionine metabolism；k：porphyrin and chlorophyll metabolism；l：terpenoid backbone biosynthesis.

Tab.2 lnformation of top 50 differential metabolites

續(xù)表2

Fig.7 Metabolic network of significantly changed metabolism pathways constructed using metabolic pathway analysis（MetPA）.The detailed construction of the altered metabolism pathways of sphingolipid metabolism（A），citrate cycle（TCA cycle）（B），cysteine and methionine metabolism（C）and glycerophospholipid metabolism（D）.Red metabolites represent the differential metabolites that have been be quantified，blue metabolites represent those that have not been quantified，and the red metabolites can be directly linked to KEGG.

3 討論

應(yīng)用UPLC-QTOF-MS/MS 技術(shù)對(duì)HCC 和LC血清的非靶向代謝組比較研究表明，HCC患者血清代謝譜發(fā)生顯著變化。通過(guò)PCA，OPLS-DA 及ANOVA 等多元統(tǒng)計(jì)分析，共篩選出438 個(gè)差異代謝物，其中差異最顯著的代謝物是潛在的早期診斷標(biāo)志物。與文獻(xiàn)報(bào)道相比較，本研究鑒定的代謝物及差異代謝物數(shù)量均有顯著增加［15，18，20，23-25］。PATTERSON 等［15］應(yīng)用UPLC-ESI-QTOF-MS、UPLC-ESI-TQ-MS 和GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)20 例HCC、17例LC、22例白血病患者及6例健康對(duì)照的血漿代謝組進(jìn)行了比較研究，共鑒定到20個(gè)差異代謝物。差異代謝物主要是溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholines，LPC）和膽汁酸。TAN 等［18］應(yīng)用LC-MS 技術(shù)對(duì)262 例HCC、76 例LC 和74 例肝炎患者的血清進(jìn)行了代謝組研究，鑒定了52個(gè)差異代謝物，其中?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA）、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0（lysophosphatidylethanolamine 16∶0，LPE 16∶0）和LPC 22∶5 作為標(biāo)志物能夠用于區(qū)分HCC，LC和肝炎患者。GAO等［20］應(yīng)用GC-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行了HCC、LC、乙型肝炎患者及健康對(duì)照的血清比較代謝組研究，發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異代謝物與肝病的進(jìn)展相關(guān)，包括氨基酸、脂肪酸和有機(jī)酸。許國(guó)旺團(tuán)隊(duì)［23］招募了1 448 名受試者，包括健康對(duì)照、慢性乙型肝炎病毒感染、HCC和LC患者，利用LC-MS 研究受試者的代謝譜，篩選出的血清代謝生物標(biāo)志物組苯丙基色氨酸和甘膽酸，聯(lián)合AFP在臨床診斷前能更好地預(yù)測(cè)臨床前HCC的風(fēng)險(xiǎn)。此外，他們采用GC-MS 對(duì)射頻消融術(shù)（radiofrequency ablation，RFA）治療前后復(fù)發(fā)患者和非復(fù)發(fā)患者的血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，提示聯(lián)合使用谷氨酸和天門冬氨酸以及聯(lián)合使用甘油和脯氨酸可能分別是預(yù)測(cè)HCC在RFA治療前后復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物［24］。KIM等［25］應(yīng)用GC-MS和LC-MS 對(duì)53 例早期HCC、47 例LC 患者和50 例健康人血清作為訓(xùn)練集，82 例早期HCC 和80 名LC樣本作為驗(yàn)證集，發(fā)現(xiàn)5種代謝物（蛋氨酸、脯氨酸、鳥氨酸、肉堿和辛酰肉堿）作為一個(gè)代謝標(biāo)志物組明顯優(yōu)于AFP。

本研究代謝物的鑒定率增加的原因主要有2個(gè)。首先是本研究對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行了4種模式的測(cè)定，RPLC和HILIC分離相互補(bǔ)充，質(zhì)譜的正負(fù)離子化方式也互相補(bǔ)充，因此大大提高代謝物鑒定覆蓋率；其次是高分辨的TripleTOFTM6600 掃描速度快，靈敏度高也是提高代謝物鑒定率的重要因素之一。

通路分析能夠揭示差異代謝物的生物學(xué)功能及其之間的關(guān)系。差異代謝物的通路分析表明，與LC 相比，HCC 患者血清中變化最顯著的代謝通路是鞘磷脂代謝，通路中有4個(gè)代謝物顯著變化，包括二氫神經(jīng)鞘氨醇磷酸酯、鞘氨醇磷酸酯、鞘磷脂和鞘氨醇。除鞘氨醇下降2.5倍外，其余3個(gè)代謝物的量都增加，變化倍數(shù)在1.8～10.55，VIP值在1.3～7.0之間。與LC 相比較，鞘氨醇在HCC 血清中的下降已有報(bào)道［35］。前期的血清代謝組研究也報(bào)道了1-磷酸鞘氨醇在HCC 血清中的增加［6］。本研究中鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇的變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［35］。這5個(gè)鞘脂代謝物是潛在的早期診斷標(biāo)志物，VIP 值較高的鞘氨醇和鞘磷脂值得進(jìn)一步驗(yàn)證。鞘磷脂代謝與粘膜保護(hù)，炎癥及腫瘤發(fā)生的關(guān)系已有報(bào)道［30，36］。鞘磷脂代謝在HCC和LC發(fā)生發(fā)展中的作用值得深入研究。

在本研究中，19 個(gè)膽汁酸相關(guān)代謝物在HCC患者血清中的量發(fā)生顯著改變，其中12個(gè)膽汁酸的量降低，7 個(gè)升高。其中變化最顯著的是甘膽酸（glycocholic acid，GCA），在RPLC-POS，RPLCNEG 和HILIC-NEG 3種模式下均檢測(cè)出且變化倍數(shù)一致，與LC 相比下降2 倍。VIP 值分別為8.0，16.0 和33.0。另外2 個(gè)差異顯著代謝物2-脫氧栗甾酮和脫氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物，VIP 值均為8.9。VIP 越大，表示對(duì)LC 和HCC 患者區(qū)分的貢獻(xiàn)越大。因此，這3個(gè)代謝物是潛在的HCC早期診斷標(biāo)志物。TCA的變化倍數(shù)為0.48，VIP為1.9。膽汁酸量的異常與LC和肝炎有一定的聯(lián)系。與正常健康對(duì)照相比較，肝病患者血清中的膽汁酸增加已被報(bào)道，包括甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、GCA、TCA 和鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）［34］。但是與LC相比較，HCC患者血清中的膽酸是下降的，主要有GCA、GDCA、TCA 和牛磺鵝去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）［6，35］，這與本研究結(jié)果一致。肝癌患者癌與癌旁組織代謝組學(xué)研究表明，癌組織中的膽酸也是下降［37］，與前期的研究相比較，本研究鑒定并定量了更多的膽汁酸相關(guān)代謝物，進(jìn)一步確認(rèn)了膽酸代謝紊亂對(duì)HCC 和LC 發(fā)生發(fā)展的影響。GCA、2-脫氧栗甾酮、脫氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物和TCA是潛在早期臨床診斷標(biāo)志物，其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用需要大規(guī)模臨床樣本的驗(yàn)證。

在本研究中，膽紅素在RPLC-NEG，HILICPOS和HILIC-NEG 3種模式中都差異顯著，變化趨勢(shì)一致，變化倍數(shù)分別為0.63，0.63和0.47。VIP值為1.8，11.8 和14.3。膽綠素在RPLC-NEG 中也顯示差異，變化趨勢(shì)與膽紅素一致。PATTERSON等［15］報(bào)道，與HCC患者相比較，LC患者血清中的膽紅素和膽綠素的量均升高。根據(jù)離子強(qiáng)度，膽紅素升高約3 倍，膽綠素升高約10 倍，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)VIP值判斷，膽紅素更有利于區(qū)分HCC和LC。膽紅素來(lái)自紅細(xì)胞的血紅蛋白中血紅素的斷裂，其經(jīng)氧化變?yōu)槟懢G素［33］。SNYDER等［26，31］研究表明，膽紅素可以保護(hù)細(xì)胞來(lái)自增加10 000倍過(guò)氧化氫引起的氧化應(yīng)激。臨床中血清膽紅素在肝膽疾病以及血液疾病的診斷中有著非常重要的作用，而在生理?xiàng)l件下膽紅素則被視為是一種天然的抗氧化劑，可對(duì)氧自由基進(jìn)行清除，促使脂質(zhì)過(guò)氧化得到有效抑制，進(jìn)而更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的控制和應(yīng)激反應(yīng)的對(duì)抗［38］。另外，有報(bào)道認(rèn)為血漿中氧化型膽紅素的升高能降低肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［27］。膽紅素在肝病各階段的作用機(jī)制及治療靶標(biāo)的價(jià)值值得深入研究［33］。血清膽紅素和膽綠素對(duì)肝癌早期診斷的臨床價(jià)值值得進(jìn)一步驗(yàn)證。

差異代謝物中，磷脂類代謝物數(shù)目最多，包括15 個(gè)磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE），7個(gè)磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），5 個(gè)磷脂酰膽堿類（phosphatidylcholines，PC），2 個(gè)磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG），2 個(gè)溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acid，LPA），2 個(gè)溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE），1 個(gè)磷脂酸（phosphatidic acid，PA）。5 種PC 在HCC 患者血清中的量均高于LC 患者血清中的量，變化差異倍數(shù)從1.55 到6.86，VIP 值從1.1 到9.6，表明PC 對(duì)HCC 和LC 的區(qū)分有重要貢獻(xiàn)。PC 在HCC 患者血清中的升高與文獻(xiàn)報(bào)道一致，盡管是不同種類的PC［32］。15 個(gè)PE 中有13 個(gè)的量在HCC血清高于LC血清，只有2個(gè)PE的量在HCC組中降低，分別是PE〔18∶3（6Z，9Z，12Z）/22∶0〕和PE（14∶0/14∶0），變化倍數(shù)為0.13和0.54。其中升高變化倍數(shù)最大的PE〔22∶5（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z）/20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）〕升高了20.89 倍。VIP 值的范圍在1.0～9.7 之間。在HCC 和LC 之間7 個(gè)PS 顯著變化，其中4 個(gè)量下降，3 個(gè)量升高，變化倍數(shù)在1.5～3.9 之間。PC，PE 和PS 之間能夠相互轉(zhuǎn)化［29］，因此，總體來(lái)講磷脂是在HCC 血清中顯著增加。文獻(xiàn)報(bào)道，PC和PE在腫瘤組織種的量顯著增加［37］，與本研究結(jié)果一致?？赡苁怯捎诩夹g(shù)方法的不同，早期的HCC代謝組學(xué)研究鑒定和定量的差異PE和PS較少，主要是PC和LPC［18］。2個(gè)PG，1個(gè)在HCC血清中的量增加，另1個(gè)量減少。另外，有2個(gè)LPE和2個(gè)LPA的量在HCC血清中降低，降低倍數(shù)分別為0.63，0.23，0.47 和0.6。VIP 值在1.8～5.3 之間。PC 在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其生物合成研究得較為深入。PE 在腫瘤進(jìn)展中的作用及其生物合成相對(duì)較少［28］。合成PE的中間代謝物磷酸乙醇胺積累有利于谷氨酰胺饑餓條件下腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［29］。本研究結(jié)果表明，磷脂代謝在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中顯著失調(diào)，靶向磷脂代謝通路有可能找到新的HCC 治療方法。變化顯著的磷脂代謝物（表2）是潛在的診斷標(biāo)志物，其臨床應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中，游離脂肪酸是另一類數(shù)目最多的差異代謝物，共檢測(cè)到25個(gè)游離脂肪酸，其中17個(gè)在HCC 血清中的量比LC 血清中低，8 個(gè)較LC 高。VIP值>5的4個(gè)游離脂肪酸分別為二十四碳六烯酸、二十二碳三烯酸、異棕櫚酸和香芹酮酰乙醇胺α-亞麻脂酸。游離脂肪酸的降低與我們前期的HCC蛋白組研究結(jié)果一致，HCC 組織中脂肪酸的β-氧化降低［20］。游離脂肪酸的失調(diào)在HCC組織與癌旁組織的代謝組學(xué)研究已有報(bào)道，不同的脂肪酸變化趨勢(shì)不同，α-亞麻脂酸在HCC組織中下降約3倍，在受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析中單獨(dú)的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.783，具有較高的區(qū)分能力［39］。在本研究中，與LC患者血清中的α-亞麻脂酸相比較，HCC血清中α-亞麻脂酸下調(diào)近2倍，VIP值5.4，在2組分組中有較大貢獻(xiàn)，與上述HCC組織中的結(jié)果一致。

與文獻(xiàn)報(bào)道不同，本研究測(cè)定的差異代謝物包含了33個(gè)小肽，主要是二肽，也有少量的四肽。33個(gè)小肽中，只有6 個(gè)小肽的量在HCC 血清中升高，其余27 個(gè)均降低。這些小肽的來(lái)源、變化及在HCC發(fā)生發(fā)展中功能尚不清楚，有待進(jìn)一步探索，小肽的鑒定是通過(guò)檢索Metlin 數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)的。另外，本研究還檢測(cè)到了10個(gè)甘油酯類化合物，8個(gè)甘油二酯，2 個(gè)單?；视停鼈兊牧吭贖CC 血清中均升高。甘油三酯升高與肝功受損有關(guān)，推測(cè)這10個(gè)甘油酯類代謝物的升高與甘油三酯的升高作用相似。小肽和甘油酯類代謝物的鑒定及差異尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，這主要源于本研究采用技術(shù)的高靈敏以及數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善。

總之，應(yīng)用基于UPLC-QTOF-MS/MS 的技術(shù)，對(duì)50例HCC及50例LC患者血清代謝組進(jìn)行了深入研究，共檢測(cè)到差異代謝物7 848個(gè)；采用嚴(yán)格的篩選條件，篩選出438個(gè)差異代謝物。據(jù)我們所知，這是目前HCC血清代謝組鑒定代謝物最多的研究，主要是由于本研究應(yīng)用RPLC 和HILIC 2種方式分離代謝物，且高分辨質(zhì)譜儀TripleTOFTM6600 具有靈敏度高和掃描速度快的優(yōu)點(diǎn)。這些差異代謝物涉及45 個(gè)代謝通路，其中12 個(gè)通路顯著變化。變化最顯著的50 個(gè)差異代謝物具有較高的早期診斷價(jià)值，值得進(jìn)一步在臨床大樣本中確認(rèn)并轉(zhuǎn)化。另外，該研究也為揭示HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了豐富的資源。