秋冬季節(jié)變化對(duì)情志相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

李佩佩 劉雷蕾 楊保林 李婷 談博 王麗濤 韓琦 馬淑然

“天人相應(yīng)”理論是中醫(yī)學(xué)的重要核心理論之一，指人體的生理變化與自然界四季的變化有著同步振蕩的關(guān)系。課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)松果腺作為“天人相應(yīng)”的中介在人體與自然界相通應(yīng)方面起著重要協(xié)調(diào)的作用，其分泌的褪黑素(melatonin，MT)作為“授時(shí)因子”，在機(jī)體內(nèi)外同步共振方面發(fā)揮中介作用。研究證明，人和雄性大鼠的MT水平都表現(xiàn)為在秋冬季節(jié)高于春季[1-2]?！鹅`樞·順一日分為四時(shí)》中提到“春生夏長(zhǎng)，秋收冬藏，是氣之常也，人亦應(yīng)之”，明確提出秋冬氣候變化以陽(yáng)氣收藏為特點(diǎn)，并提到人體存在與之相對(duì)應(yīng)的生理現(xiàn)象。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)秋冬季節(jié)易發(fā)抑郁癥，Garvey報(bào)告顯示抑郁癥季節(jié)性發(fā)病率為38%,其中秋冬季節(jié)發(fā)病者占28%[3]。目前,關(guān)于季節(jié)變化對(duì)秋冬情志類疾病的研究不足，因此本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究秋冬季節(jié)變化對(duì)5-羥色胺(5-hydroxyryptamine，5-HT)、去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamic，Glu)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)情緒相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌的影響，以探討“天人相應(yīng)”理論的微觀機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，5周齡，秋冬季節(jié)各24只，共48只。體重150～170 g，分別在秋分(2018年9月23日)、冬至(2018年12月22日)前由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司37日購(gòu)入，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2018-0002。飼養(yǎng)條件：室溫(冬季為17±2℃，夏季為25±2℃)，自然光，自由汲取水及飼料，飼料由普通鼠全價(jià)顆粒飼料,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)通過北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，符合相關(guān)倫理學(xué)要求，倫理審查編號(hào)：BUCM-4-2018111301-1011。

1.2 試劑和儀器

安亭離心機(jī)(中國(guó)，TGL-16G)；伽馬放射免疫計(jì)數(shù)器(中國(guó)，XH6080)；漩渦混合器(美國(guó)，Vortex-Genie 2 SI-0246)；牙科打磨機(jī)(韓國(guó)，saeshin 204)；牙科鉆鉆頭(德國(guó)，MEISINGER HM1014)；水合氯醛(中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；5-羥色胺酸酶聯(lián)免疫科研試劑盒(德國(guó)Labor Diagnostika Nord公司，批號(hào)：BAR-8900)；去甲腎上腺素酶聯(lián)免疫試劑盒(德國(guó)Labor Diagnostika Nord公司，批號(hào)：BAE-5500)；γ-氨基丁酸酶聯(lián)免疫科研試劑盒(德國(guó)Labor Diagnostika Nord，批號(hào)：BAE-2500)；谷氨酸酶聯(lián)免疫科研試劑盒(德國(guó)Labor Diagnostika Nord，批號(hào)：BAE-2400)；促腎上腺皮質(zhì)激素酶聯(lián)免疫科研試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.3 分組及造模

將大鼠隨機(jī)分為生理組、偽手術(shù)組(不摘除松果腺)、手術(shù)組(摘除松果腺)，每組8只，偽手術(shù)組和手術(shù)組分別于秋分、冬至前30天手術(shù)造模，與生理組在相同條件下飼養(yǎng)30天。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(用量：0.4 mL/100 g)。待大鼠角膜反射消失后，固定頭部，酒精消毒，縱向剪開頭皮約2 cm，在矢狀縫和人字縫兩側(cè)用牙科鉆切割矩形骨長(zhǎng)約0.5 cm，寬約0.2 cm，暴露矢狀靜脈竇(sagittal sinus vein，SSV)、橫向靜脈竇(transverse sinus，TS)和竇匯(collective sinus, CS)。沿SSV兩側(cè)縱向切開硬腦膜，結(jié)扎SSV上兩點(diǎn)，在結(jié)扎中間以手術(shù)刀切斷，靠近CS端，以彎鑷伸入取下松果腺，明膠海綿止血，縫合皮膚后滴少量青霉素防止感染，放于籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，即手術(shù)組造模成功。偽手術(shù)組造模操作過程與手術(shù)組大致相同，不同之處是在靠近CS端以彎鑷伸入時(shí)并不取下松果腺。正常組不給予任何處理措施。

1.4 取材及檢測(cè)方法

于秋分、冬至當(dāng)天晚20點(diǎn)開始，暗室內(nèi)紅光5周照明，首先以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉, 腹主動(dòng)脈采血5～7 mL于普通生化管內(nèi)，后斷頭，將鼠頭置于盛滿碎冰的托盤里，取出大腦置于稱量紙上，將海馬從腦皮質(zhì)中分離，后放入凍存管內(nèi)，-80℃冰箱保存，靜脈血以3000 r/min，4℃離心15分鐘，取上層血清，-80 ℃冰箱保存，待用。

海馬體中5-HT、NE、Glu、GABA、血清ACTH含量測(cè)定方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 ELISA法檢測(cè)海馬體中5-HT、NE、Glu、GABA含量 待海馬組織解凍，稱量海馬組織0.1g，加入10倍體積PBS緩沖液(0.01M，pH 7.4)，以20℃、3000 r/min，離心10分鐘，提取上層清液待用。在對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，在對(duì)應(yīng)空白孔中加入50 μL樣品，各記錄編號(hào)，在樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入酶標(biāo)試劑100 μL。封板后室溫下孵育60分鐘，洗液洗板5次，每次靜置30秒鐘，每孔加入A、B兩種顯色劑各50 μL，室溫下顯色15分鐘。每孔加入50 μL終止液，以空白孔調(diào)零，于450 nm下讀取各孔OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)樣品所測(cè)得OD值經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得樣品濃度。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清ACTH含量 將血清解凍半小時(shí)。在樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔對(duì)應(yīng)加入100 μL液體。每孔加入100 μL稀釋液，封膜，室溫下孵育震蕩15分鐘。加入洗液300 μL洗板3次，每次靜置30秒。加入100 μL，加100 μL底物至各孔中，室溫(20～25 ℃)震蕩(600 r/分鐘)溫育20～30分鐘。加入100 μL終止液至各孔中,反應(yīng)15分鐘。450 nm下讀取各孔OD值。 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)樣品所測(cè)得OD值經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中5-HT含量變化

由表1可知，大鼠海馬5-HT含量生理組秋分與冬至比較，秋高冬低，有顯著差異(P<0.05);正常狀態(tài)下，5-HT含量存在秋高冬低的季節(jié)節(jié)律。摘除松果腺后，秋分與冬至手術(shù)組相比，無顯著差異，即摘除松果腺后5-HT秋高冬低節(jié)律被打亂，松果腺可能對(duì)5-HT季節(jié)節(jié)律起調(diào)節(jié)作用。秋分時(shí)5-HT三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，偽手術(shù)組>生理組>手術(shù)組，組間差異顯著(P<0.05)，說明秋季手術(shù)和摘除松果腺對(duì)大鼠5-HT含量有影響，手術(shù)應(yīng)激會(huì)刺激其分泌增加，摘除松果腺后5-HT含量明顯下降。冬至?xí)r5-HT的含量三組數(shù)據(jù)相比，手術(shù)組>偽手術(shù)組>生理組，其中手術(shù)組與生理組相比，有顯著差異(P<0.05)，偽手術(shù)組與生理組相比，無顯著差異，說明冬季松果腺對(duì)5-HT分泌起調(diào)節(jié)作用。即在冬季時(shí)摘除松果腺對(duì)大鼠海馬5-HT含量上調(diào)作用顯著。

表1 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中5-HT含量比較

注： 與本組秋分相比，aP<0.05；與同一季節(jié)生理組相比，bP<0.05。

2.2 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中NE含量變化

由表2可知，大鼠海馬NE含量生理組秋分與冬至相比，冬至較高，有顯著差異(P<0.05)，說明正常狀態(tài)下，存在NE含量冬高秋低的季節(jié)節(jié)律。偽手術(shù)組秋分與冬至相比，冬至較高，有顯著差異(P<0.05)，說明手術(shù)應(yīng)激情況下，NE含量仍存在冬季高于秋季的季節(jié)節(jié)律。手術(shù)組秋分與冬至相比較，冬至較高，有顯著差異(P<0.05)，與正常狀態(tài)下冬高秋低的節(jié)律相同。即手術(shù)應(yīng)激和摘除松果腺均未改變海馬NE冬高秋低的季節(jié)節(jié)律。同季節(jié)秋分與冬至三組相比，均無顯著差異，說明秋冬季節(jié)摘除松果腺對(duì)NE調(diào)節(jié)不顯著。從結(jié)果看出，摘除松果腺后，無論組間對(duì)比還是季節(jié)對(duì)比，都無顯著差異，說明NE分泌水平可能不受松果腺調(diào)控，這有待于進(jìn)一步開展相關(guān)研究以探索其季節(jié)節(jié)律。

表2 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中NE含量比較

注： 與本組秋分相比，aP<0.05。

2.3 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中GABA含量變化

由表3可知，大鼠海馬GABA生理組秋分與冬至相比，秋高冬低，有顯著差異(P<0.05)，存在生理狀態(tài)下，秋高冬低的季節(jié)節(jié)律。偽手術(shù)組秋分與冬至相比，秋高冬低，有顯著差異(P<0.05)，說明手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)未改變GABA的季節(jié)節(jié)律。手術(shù)組秋分冬至相比，秋高冬低，有顯著差異(P<0.05)，摘除松果腺后與正常狀態(tài)下節(jié)律相同，說明松果腺可能不對(duì)GABA的季節(jié)節(jié)律產(chǎn)生影響。冬至三組相比，生理組>偽手術(shù)組>手術(shù)組，生理組與手術(shù)組相比，手術(shù)組含量明顯下降，有顯著差異(P<0.05)，生理組與偽手術(shù)組相比，差異不顯著，說明冬季摘除松果腺可能會(huì)對(duì)GABA的分泌產(chǎn)生影響，松果腺分泌的褪黑素在冬季有促進(jìn)GABA分泌作用。

表3 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中GABA含量比較

注： 與本組秋分相比，aP<0.05；與同一季節(jié)生理組相比，bP<0.05。

2.4 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中Glu含量變化

由表4可知，海馬Glu含量生理組秋分與冬至相比，冬至較高，有顯著差異(P<0.05)，存在正常狀態(tài)下冬季高于秋季的季節(jié)節(jié)律。偽手術(shù)組秋分與冬至相比，差異不顯著，手術(shù)組秋分與冬至相比，差異不顯著。即手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)和摘除松果腺后Glu季節(jié)性節(jié)律在某種程度上消失或紊亂。同季節(jié)相比，秋分時(shí)手術(shù)組與生理組相比，手術(shù)組較高，有顯著差異(P<0.05)，偽手術(shù)組與生理組相比，差異不顯著，說明秋季摘除松果腺后，對(duì)Glu含量上調(diào)作用顯著。

表4 秋冬各組大鼠海馬組織勻漿中Glu含量比較

注： 與本組秋分相比，aP<0.05；與同一季節(jié)生理組相比，bP<0.05。

2.5 秋冬各組大鼠血清中ACTH含量變化

由表5可知，大鼠血清ACTH含量生理組秋分與冬至相比，秋高冬低，有顯著差異(P<0.01)，正常狀態(tài)下，存在秋季高于冬季的季節(jié)節(jié)律。偽手術(shù)組秋分與冬至相比，有顯著差異(P<0.05)，存在冬季高于秋季的季節(jié)節(jié)律,與生理狀態(tài)下情況相同。手術(shù)組秋分與冬至相比，差異不顯著，說明摘除松果腺后，ACTH秋高冬低的季節(jié)節(jié)律被打亂。同一季節(jié)冬至?xí)r三組相比，生理組與偽手術(shù)比較，有顯著差異(P<0.05)，生理組與手術(shù)組比較，有顯著差異(P<0.05)，冬季摘除松果腺與手術(shù)應(yīng)激對(duì)ACTH上調(diào)作用顯著。秋分時(shí)三組相比，均無顯著差異，秋季摘除松果腺對(duì)ACTH調(diào)節(jié)不顯著。

表5 秋冬各組大鼠血清中ACTH含量比較

注： 與秋分生理組相比，aP<0.05；與秋分偽手術(shù)相比，bP<0.05；與同一季節(jié)生理組相，cP<0.05。

3 討論

有實(shí)驗(yàn)表明，海馬可能是調(diào)節(jié)情志方藥的作用區(qū)域[4]。海馬區(qū)存在調(diào)節(jié)情志的重要神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)[5]。有學(xué)者[6]最早提出抑郁狀態(tài)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT降低有關(guān)。這一假說在后來得到了證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠存在海馬區(qū)5-HT水平降低[7]。有學(xué)者[8]早在1965年提出抑郁癥是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NE不足導(dǎo)致。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血漿中NE含量升高，而非降低。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)主要是GABA和Glu參與情志病的發(fā)生發(fā)展，GABA是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在抑郁患者血漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)GABA水平降低[9]。Glu是腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實(shí)，疏肝解郁方藥能夠調(diào)節(jié)海馬區(qū)GABA水平[10]。外周血中Glu含量降低與抑郁癥有關(guān)[11]。研究證明，存在抑郁狀態(tài)下大鼠和人類血漿中ACTH水平增高[12-13]。經(jīng)抗抑郁治療后，ACTH水平降低。

松果腺分泌的MT可能是自然界四時(shí)與人體五臟相通應(yīng)的中介。MT可感受外界光線明暗的變化，其內(nèi)源性合成依賴光周期，自然界四時(shí)光照引起MT的季節(jié)性變化進(jìn)而影響五臟的生理功能可能是“五臟應(yīng)時(shí)”的生理機(jī)制。前期課題實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，MT在情志調(diào)節(jié)和心理應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用[14]。海馬、下丘腦所在的邊緣系統(tǒng)參與抑郁癥的調(diào)節(jié)，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸有關(guān)。因此選擇海馬中單胺類和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)及血清中HPA軸相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)ACTH，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究季節(jié)變化對(duì)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。

3.1 秋冬季節(jié)變化對(duì)情志相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)分泌水平存在影響

本研究結(jié)果表明，生理狀態(tài)下，海馬5-HT、GABA含量、血清ACTH含量呈現(xiàn)秋高冬低的季節(jié)變化規(guī)律，具有顯著差異(P<0.05),海馬NE、Glu含量呈現(xiàn)冬高秋低的季節(jié)變化節(jié)律，具有顯著差異(P<0.05)，說明秋冬季節(jié)變化對(duì)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)分泌水平存在影響。在生理狀態(tài)下，不同的神經(jīng)遞質(zhì)情志存在不同的季節(jié)節(jié)律性，這可能與中醫(yī)理論中“五臟應(yīng)五時(shí)”“五臟主五志”相關(guān)，也可能預(yù)示秋冬季節(jié)抑郁發(fā)病的物質(zhì)基礎(chǔ)，是中醫(yī)“天人相應(yīng)”的理論微觀機(jī)制之一。

3.2 秋冬季節(jié)松果腺對(duì)海馬5-HT、Glu、GABA和ACTH分泌有調(diào)節(jié)作用

5-HT是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在生命節(jié)律中起重要的調(diào)節(jié)作用，屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。抑郁癥有關(guān)5-HT的假說認(rèn)為，抑郁癥是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT釋放減少，突觸間隙含量下降所致[15]。生理狀態(tài)下秋冬兩季海馬5-HT水平秋高冬低，具有顯著差異(P<0.05)，秋冬季手術(shù)組相比，無顯著差異，即摘除松果腺后5-HT的正常節(jié)律消失。松果腺分泌的褪黑素對(duì)5-HT的季節(jié)節(jié)律有影響，冬季時(shí)三組比較，手術(shù)組與生理組相比升高，有顯著差異(P<0.05)，偽手術(shù)組與生理組相比無顯著差異，說明冬季摘除松果腺對(duì)5-HT分泌有影響，冬季松果腺對(duì)5-HT有調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，NE在正常狀態(tài)下存在冬高秋低的節(jié)律，摘除松果腺后，NE節(jié)律仍然存在，秋冬季節(jié)摘除松果腺后，與生理組并無顯著差異。即秋冬季節(jié)海馬中NE含量可能不受松果腺調(diào)控。

GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制類神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明GABA極其受體水平異常與多種精神類疾病密切相關(guān)，如癲癇、阿爾茨海默病和抑郁[16]。Glu為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明，二者之間相對(duì)平衡是避免精神類疾病發(fā)作的基礎(chǔ)，有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠海馬GABA含量明顯降低，Glu含量明顯上升[17]。

本實(shí)驗(yàn)可以看出生理狀態(tài)下，海馬GABA存在秋高冬低的季節(jié)節(jié)律，而Glu存在秋低冬高的節(jié)律。摘除松果腺后GABA水平秋冬季兩組相比，秋高冬低，仍有顯著差異(P<0.05),與生理狀態(tài)下相同，說明GABA季節(jié)節(jié)律可能不受松果腺調(diào)控。同樣，摘除松果腺后Glu水平，與秋冬季相比，無顯著差異，其節(jié)律性打亂，說明松果腺對(duì)Glu節(jié)律有調(diào)控作用。冬季時(shí)，GABA手術(shù)組與生理組水平相比，手術(shù)組降低，有顯著差異(P<0.05)，偽手術(shù)組與生理組相比無顯著差異，摘除松果腺后對(duì)GABA分泌水平有影響，冬季摘除松果腺后，GABA分泌水平下降，GABA冬季受松果腺調(diào)控。秋季三組比較，無顯著差異，說明秋季松果腺對(duì)GABA調(diào)節(jié)不顯著。秋季時(shí)，摘除松果腺后，Glu水平顯著升高。冬季摘除松果腺，無明顯改變，說明秋季時(shí)松果腺對(duì)Glu調(diào)節(jié)顯著，冬季調(diào)節(jié)不顯著，與GABA季節(jié)調(diào)節(jié)性相反。

研究證明，降低ACTH水平能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)免疫功能，改善抑郁患者癥狀[18]。結(jié)果顯示：生理狀態(tài)下秋季ACTH水平明顯高于冬季(P<0.05)，偽手術(shù)組秋冬季相比，秋季高于冬季，具有顯著差異 (P<0.05)，秋季生理組與手術(shù)組相比，差異不顯著，偽手術(shù)組與生理組相比，差異不顯著，說明秋季松果腺對(duì)ACTH調(diào)節(jié)不顯著，這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道一致。冬季生理組與手術(shù)組相比差異顯著(P<0.05)，手術(shù)組高于生理組，偽手術(shù)組與生理組相比差異顯著(P<0.05)，說明冬季手術(shù)創(chuàng)傷和摘除松果腺均能使ACTH一定程度升高。松果腺對(duì)ACTH調(diào)控具有季節(jié)選擇性。

3.3 松果腺調(diào)控的情志類相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)季節(jié)性變化可能是精神類疾病季節(jié)發(fā)作的基礎(chǔ)之一

“天人相應(yīng)”理論強(qiáng)調(diào)“天人合一”思想，指自然界的四季變化與人體四季生理變化相通應(yīng)。松果腺作為“五臟應(yīng)時(shí)”的中介，發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過摘除松果腺觀察秋冬季節(jié)氣候變化對(duì)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)生理情況下，5-HT、GABA具有季節(jié)節(jié)律性，二者皆呈現(xiàn)秋高冬低的特點(diǎn)，NE、Glu、ACTH存在冬高秋低的節(jié)律。摘除松果腺后，5-HT、ACTH和Glu季節(jié)節(jié)律性消失或發(fā)生某種程度的紊亂，表明摘除松果腺后，機(jī)體不能“應(yīng)時(shí)而變”，進(jìn)而導(dǎo)致季節(jié)性相關(guān)情志疾病的產(chǎn)生。